1.2.2. Обнаружение специфичных для болезни форм PrP

1. 2. 2. Обнаружение специфичных для болезни форм PrP

Универсальное применение методов обнаружения PrP обеспечивает специфическими средствами диагностики болезни независимо от

морфологических изменений, выявленных посредством гистопатологии. Многие лаборатории уже дополняют или заменили гистопатологическое исследование иммуногистохимией и/или другими методами обнаружения PrP. Обнаружение скопления белков PrPSc является предпочтительным методом для программ надзора и подтверждающей диагностики. Применение иммуногистохимии в отношении PrP на материале, который был заморожен до фиксации, является возможным (но не нежелательным) (Debeer et al., 2002). Замораживание до фиксации не скажется отрицательно на иммунореактивности образца, но может оказать отрицательное воздействие на соответствующую идентификацию целевых областей. Положительный случай будет иметь иммуномечение, по крайней мере, в одной из диагностических целевых областей (Casalone et al., 2006). Чтобы диагностировать случай как отрицательный, должна быть возможность идентификации наличия целевых областей и подтверждения того, что «цикл» иммуногистохимии был проведен технически успешно с использованием соответствующих контролей. Если специфического для болезни иммуномечения не наблюдается и целевые области идентифицировать невозможно, то случай нужно классифицировать как «неподтвержденный» в отличие от отрицательного. Оба варианта H и L типов демонстрируют скопление PrPSc в продолговатом мозге на уровне мозга (Casalone et al., 2006; Gavier-Widen et al., 2008). Охват и морфологические характеристики иммуномечения в осевой части нервной системы отличаются от классического ГЭ КРС. Общей чертой вариантных форм является наличие небольших многочисленных бляшко-подобных осадков. Различия в стволе мозга (обексе) не всегда видны и на них нельзя полагаться, чтобы эффективно дифференцировать или классифицировать случаи.

1. 2. 2. 1. Иммуногистохимические методы

Иммуногистохимические исследования для обнаружения скоплений PrPSc проводят в таком же зафиксированном формалином и погруженном в парафин материале, используемом для гистопатологической диагностики. В иммуногистохимических исследованиях для обнаружения PrPSc с целью диагностики ГЭ КРС успешно применялись

различные протоколы. Несмотря на то, что стандартизированный метод иммуногистохимии является наиболее предпочтительным, более важным является определение надежных методов, имеющих стандартные результаты, контроль которых осуществляется на основе участия в сличительных испытаниях и сравнения с результатами стандартизованного образцового метода, применяемого в референтной лаборатории. Общий метод для гистопатологического исследования все еще успешно использует аутолизированные ткани, где проведение морфологической оценки уже является невозможным (Monleon et al., 2003). Однако необходимо изучить анатомию образца, для того, чтобы определить, имеются ли целевые области. Это важно для постановки отрицательного диагноза, а также для точной интерпретации неопределенного иммуномечения. Метод обнаружения скоплений PrPSc при помощи иммуногистохимии так же чувствителен, как и метод вестерн-блоттинга для обнаружения скопления PrPSc (Schaller et al., 1999). В комбинации с хорошими гистологическими препаратами иммуногистохимия позволяет обнаружить скопления PrPSc и, как и вакуолярная патология, имеет типичный вид и картину распределения. Она позволяет проводить одновременную оценку или подтверждать фенотип болезни. Существующие методы можно получить, обратившись в референтные лаборатории МЭБ.

По сравнению с диагностикой скрепи овец ограниченное обнаружение PrPSc в лимфоидных тканях при ГЭ КРС не дает возможности использования таких тканей для проведения доклинического анализа с использованием методов биопсии.

1. 2. 2. 2. Метод Вестерн-блоттинга

Методы Вестерн-блоттинга проводят на свежих (незафиксированных) тканях и их можно успешно применять даже в том случае, если ткань аутолизирована (Hayashi et al., 2004). Иммуноблоттинг скрепиассоциированных фибрилл (Stack et al., 2004) был первым таким методом, который

применяли для диагностики ГЭ КРС. Он имеет чувствительность, сходную с чувствительностью иммуногистохимических методов и наряду с иммуногистохимией остается предпочтительным методом для подтверждения ГЭ КРС. Он является высокочувствительным методом, при применении которого используют большую массу (в идеале 2-4 г. ) исходного материала и который предполагает несколько этапов концентрации PrPSc. В настоящее время доступны альтернативные методы, требующие меньше временных и денежных затрат. При их проведении используется меньше материала, и они являются более практичными. Несколько методов Вестерн иммуноблотинга доступны на TSE-LAB-NET3 в других референтных лабораториях МЭБ по ГЭ КРС. Несмотря на то, что методологию Вестерн-блоттинга сейчас применяют во всем мире, аналитическая чувствительность методов, используемых в разных лабораториях, имеет значительные различия при ее использовании для обнаружения PrPSc. Там, где применение собственных методов является более предпочтительным, чем применение опубликованных методов, важно, чтобы они прошли оценку на соответствие своей цели, и чтобы их валидировали по согласованию с референтной лабораторией МЭБ.

3 http: //www. tse-lab-net. eu/

4 http: //www. tse-lab-net. eu/documents/tse-rl-blot. pdf.

МЭБ и государственные референтные лаборатории создали методы Вестерн-блотинга для установления различия между вариантами H и L и классической ГЭ КРС. Различие основано на четком расщеплении N- конечной протеазы К, реактивности антител и паттерне гликозилированияPrPres (Jacob et al., 2007). Подробный протокол, включая критерии диагностики были выпущены референтной лабораторией Европейского Союза и доступен онлайн на A TSE-LAB-NET4.