1.1.1. Отбор стволовой части мозга при активном надзоре с использованием экспресс методов тестирования

1. 1. 1. Отбор стволовой части мозга при активном надзоре с использованием экспресс методов тестирования

Отбор образцов ткани головного мозга и ее обработка с целью использования в любом экспресс тесте должны выполняться точно в соответствии с инструкцией поставщика или производителя метода тестирования или набора. Процедуры проведения методов отличаются друг от друга и их нельзя менять без результатов валидации вариантной методологии, проведенной производителем. С целью демонстрации скоплений PrPSc и оценки отбора образцов для проведения экспресс-тестов предпочтительный для иммуноанализа образец должен быть отобран из области, находящейся в 1, 0 см или в пределах 1, 0 см рострально или каудально от обекса исходя из каудально-ростральной зоны ключевых целевых точек (Рис. 3). Выбор целевой точки должен учитывать последующий метод подтверждения. Если положительные результаты потребуют подтверждения, то, по крайней мере, полусрез продолговатого мозга на уровне обекса нужно сохранять интактным с целью фиксации для проведения иммуногистохимии/гистологии (как описано выше). Отбор образцов продолговатого мозга рострально или каудиально от обекса для экспресс-тестирования не оказывает отрицательного влияния на гистологические и иммуногистохимические методы исследования. Однако

для получения адекватных образцов для проведения экспресс-тестирования и подтверждающего тестирования отбор образцов полусреза продолговатого мозга на уровне обекса является более предпочтительным. Несмотря на то, что в результате теряется возможность оценить симметрию любых гистологических поражений (в частности вакуоляцию), данный подход наименее всего может отрицательно повлиять на проведение наиболее важного иммуногистохимического исследования. Если все-таки выбирают приготовление полусреза, то важно принять меры, чтобы на целевые точки каждого образца не было отрицательного воздействия. Например, ядро одиночного пучка и дорсальное двигательное ядро черепного нерва (целевые области поражений, вызванные ГЭ КРС) являются маленькими и расположены относительно близко к срединной линии (Рисунок 3). Если образцы ткани аутолизируют до той степени, когда анатомическая ориентация невозможна, неидентифицированную аликвоту все же можно взять и протестировать. Положительный результат в таких случаях является действительным результатом. Но отрицательный результат тестирования нельзя истолковывать как индикатор отрицательного животного. Его необходимо интерпретировать с особой осторожностью и сообщать о нем нужно с соответствующим заключением.

Рисунок 3. Поперечный разрез стволовой части головного мозга на уровне обекса, показывающий ключевые целевые точки для диагностики с помощью гистопатологии и иммуногистохимии при ГЭ КРС. Здесь продемонстрированы ядро одиночного пучка (1), ядро спинномозгового пути тройничного нерва (2) и дорсальное ядро блуждающего нерва(3). Из этого следует, что материал, отобранный для проведения экспресс-теста, должен также включать репрезентации данных зон.

Результатом неточного приготовления полусреза может быть полная потеря целевой области для проведения подтверждающего тестирования и угроза проведению программы надзора. Неправильное применение специальных инструментов для отбора образцов может также быть причиной неаккуратного отбора образцов из целевых областей. Внедрение данных подходов требует четкой стратегии и программы мониторинга с целью обучения и контроля качества процедур отбора образцов, включая анатомическую ориентацию, а не только вес образца. Из-за специфически целевого распределения PrPsc размер образцов и расположение должно соответствовать описанию, данному в диагностических наборах. Если указаний нет, то для проведения всех подтверждающих тестов нужно отбирать, по крайней мере, 0, 5 г из диагностических целевых областей, как показано на рисунке 3. Рабочие характеристики исследования могут быть поставлены под угрозу по причине аутолиза, а именно из-за потери способности обеспечивать включение целевых областей в образец, отобранный для диагностики.

1. 2. Диагностическое исследование

1. 2. 1. Гистологическое исследование

Гистопатология уже давно не является единственным методом для проведения исследований подозрительных животных или скрининга здоровых популяций. Однако осведомленность о гистопатологических изменениях является важным фактором для облегчения обнаружения случаев, когда проводится плановые диагностические гистологические исследования головного мозга КРС, образцы которого были отобраны для других исследований, помимо ГЭ КРС.

Для проведения дифференциальной диагностики осуществляют приготовление срезов продолговатого мозга-обекса толщиной 5 мкм, которые окрашивают гемотоксилином и эозином (H& E). Если качество ткани позволяет, то гистопатологическое исследование срезов, окрашенных H& E, может подтвердить характерные невропатологические изменения ГЭ КРС (Simmons et al., 1996; Wells & Wilesmith, 1995), по которым болезнь была впервые распознана как губкообразная энцефалопатия. Эти изменения включают в основном губкообразные изменения и неврональную вакуоляцию; они являются сходными со всеми другими ТГЭ, но при ГЭ КРС

частая периодичность невропаренхимальной вакуоляции в определенных анатомических ядрах продолговатого мозга на уровне обекса может быть использована для проведения гистопатологической диагностики одного среза продолговатого мозга. Так же, как и у других видов вакуолярные изменения в мозге КРС, особенно вакуоли в части нейрона, которая содержит ядро, красного или окуломоторного ядра среднего мозга, были обнаружены случайно (Gavier-Widen et al., 2001). При проведении гистопатологической диагностики нельзя полагаться только на вакуолцию нейрона, особенно в данных анатомических локализациях. Независимо от гистопатологической диагностики рекомендуется применять иммуногистохимию в плановой диагностике дополнительно, так как неопубликованные факты говорят о том, что, по крайней мере, 5 % клинических подозрительных случаев (которые являются отрицательными при исследовании среза, окрашенного H& E, с целью обнаружения вакуолярных изменений около обекса) можно диагностировать с использованием иммуногистохимии. Ясно, что исследования продолговатого мозга-обекса не позволяют проводить полное невропатологическое исследование для дифференциальной диагностики, они также не позволяют проводить полную фенотипическую характеристику любой ТГЭ. Именно по этой причине рекомендуется удалять головной мозг из животных с подозрениями целиком. До сих пор информации для описания специфичных гистопатологических характеристик ГЭ КРС типа H и L нет. Итальянские исследования имеют некоторую информацию по гистологии АГЭ КРС (L-тип ГЭ КРС) (Cassalone et al., 2004). При пассивном надзоре было обнаружено несколько атипичных случаев ГЭ КРС и при активном надзоре не является возможным получить мозг целиком с целью получения знаний по данному вопросу. Плохое состояние мозга павшего КРС, где и были в основном идентифицированы атипичные случаи, также исключает проведение полного гистологического исследования из-за действия аутолиза. Была описана конечная патология при ГЭ КРС типов L и Н у небольшого количества животных после внутрицеребрального заражения (Konold et al., 2014; Okada et al., 2011).