 |
1.2.1. Полимеразная цепная реакция в реальном времени для обнаружения ВВД КРС в сперме
|
|
|
|
ОТ ПЦР в реальном времени является очень полезной для скрининга образцов спермы для подтверждения свободы от ВВД КРС и помимо скорости обычно дает отличные результаты по выделению вируса в клеточной культуре, особенно, когда присутствуют низкие уровни вируса, такие, которые можно обнаружить в персистентно инфицированных быках. В ОТ-ПЦР в реальном времени, описанном здесь, используют пару праймеров, специфичных к последовательности для амплификации целевого ДНК и олигозонда 5’-нуклеазы для обнаружения амплифицированных продуктов. Олигозонд – это единичный, специфичный к последовательности олигонуклеид, меченый двумя разными флуорофорами. Праймеры и
зонды доступны в продаже и доступно несколько разных вариантов флуорофоров. Данный анализ ОТ-ПЦР в реальном времени для обнаружения пан-пестивирусов создан для обнаружения вирусного ДНК всех штаммов ВВД КРС 1 и ВВД КРС 2, а также вируса пограничной болезни овец (BDV), КЧС и большинства атипичных пестивирусов. Анализ выборочно амплифицирует последовательность из 208 пар оснований 5’ нетранслируемой области (5’ NTR) генома пестивируса. Информация о праймерах и зондах представлена в протоколе, указанном ниже.
i) Подготовка проб, оборудования и реагентов
a) Образцы, используемые для исследования, это обычно разбавленная бовиная сперма или иногда свежая сперма. Если тестирование образцов осуществляется только с использованием ОТ-ПЦР в реальном времени, приемлема их доставка в охлажденном виде, но они должны быть холодными, когда поступают в лабораторию. В ином случае, если холодовую цепь нельзя обеспечить или если проводится выделение вируса, образцы спермы должны быть транспортированы в лабораторию в жидком виде или на сухом льду. В лаборатории пробы нужно хранить в жидком азоте или при температуре ниже -70º С (для длительного хранения) или 4º С (для кратковременного хранения до 7 дней). Обратите внимание на тот факт, что образцы для выделения вируса нельзя хранить при температуре 4º С более 1-2 дней.
|
|
|
b) Из-за очень высокой аналитической чувствительности ОТ-ПЦР в реальном времени, могут быть использованы гораздо меньшие объемы спермы. Однако, по крайней мере, нужно обработать три соломинки (минимально 250мкл каждая) из каждой партии отобранной спермы. Сперму в трех соломинках нужно объединить в пул и тщательно смешать перед отбором образца для выделения нуклеиновой кислоты.
c) Для проведения анализа требуются система обнаружения ОТ-ПЦР в реальном времени и соответствующее программное обеспечение для анализа данных. Количество систем обнаружения ОТ-ПЦР можно приобрести у разных производителей. Другое оборудование, требуемое для теста включает микроцентрифугу, охлаждающий блок, микровортекс и микропипетки. Так как методы ОТ-ПЦР в реальном времени могут обнаружить очень маленькие количества целевых молекул нуклеиновой кислоты, необходимо предпринять соответствующие меры для предотвращения контаминации, включая специально предназначенные и физически сепарированные «чистые» зоны для приготовления реагента (где не работают с образцами и материалами, используемыми для ПЦР), специальные зоны для обработки проб и изолированную зону для термоциклера и соответствующего оборудования. В каждой зоне должны находиться специально предназначенные реактивы и оборудование. Более того можно проводить обработку только
одного образа параллельно, чтобы контролировать возможность контаминации низкого уровня. Источники контаминации могут включать передачу продукта из положительных образцов или, что более часто встречается, перекрестную контаминацию продуктами ПЦР, полученными при ранее осуществляемой работе.
|
|
|
d) Анализ ОТ-ПЦР в реальном времени включает две отдельные процедуры.
1) Во-первых, ВВД КРС выделяют из спермы, с использованием валидированного метода экстрагирования нуклеиновой кислоты. Рекомендуются системы, использующие магнитные микроносители для захвата и очистки нуклеиновой кислоты. Также предпочтительно, чтобы манипуляции с микроносителями осуществлялись с использованием полуавтоматической системы работы с магнитными частицами.
2) Вторая процедура – анализ ОТ-ПЦР экстрагированной матрицы РНК в системе ОТ-ПЦР в реальном времени.
ii) Экстрагирование РНК
РНК или цельную нуклеиновую кислоту экстрагируют из объединенного образца спермы (три соломинки, отобранные в то же время от одного и того же животного). Рекомендуется использовать коммерчески доступный набор для экстрагирования с использованием магнитных микроносителей. Однако предпочтительным является набор, который прошел оценку для обеспечения оптимального экстрагирования трудных образцов (сперма и цельная кровь) Некоторые системы и протоколы наборов в значительной степени очищены, поэтому нет необходимости удалять клетки из образца спермы. До экстрагирования нужно развести образец спермы, объединенный в пул, в фосфатно-буферным растворе с добавлением желатина или подобном буферном растворе, ¼. Завершите экстрагирование РНК, взяв 50 мкл разведенного, объединенного в пул образца и добавьте его в буфер для лизиса образца. Некоторые коммерческие наборы для экстрагирования могут потребовать использования большего объема. Также было обнаружено, что удовлетворительные результаты можно получить посредством добавления 25 мкл неразведенного объединенного в пул образца в буфер для лизиса образца. Завершите экстрагирование, следуя инструкции производителя набора.
iii) Процедура проведения ОТ-ПЦР в реальном времени
a) Реакционная смесь: Существует несколько коммерческих наборов ОТ-ПЦР в реальном времени для амплификации, которые можно приобрести в разных источниках и выбранные наборы должны быть сопоставимы с выбранной платформой для ОТ-ПЦР.
|
|
|
Требуемые праймеры и зонды могут быть синтезированы различными коммерческими компаниями. Референтная лаборатория МЭБ по ВВД КРС может предоставить информацию о подходящих поставщиках.
b) Доставка и хранение реактивов: Реакционная смесь для ОТ-ПЦР в реальном времени обычно поступает готовой к использованию с концентрации 2×. Инструкции производителя необходимо соблюдать при использовании и хранении. Исходные рабочие растворы для праймеров и зонда готовят с использованием воды бенуклеазы в концентрации 20 мкМ и 3 мкМ, соответственно. Исходные растворы хранят при температуре - 20º С и раствор зонда нужна хранить в темном месте. Аликвоты одноразового и ограниченного использования можно приготовить для ограничения замораживания-оттаивания праймеров и зондов и продлить их срок хранения.
c) Последовательности праймеров и зондов
Выбор праймеров и зондов описан Hoffman et al. (2006) и обобщен внизу.
Прямая: BVD 190-F 5’-GRA-GTC-GTC-ART-GGT-TCG-AC
Обратная: V326 5’-TCA-ACT-CCA-TGT-GCC-ATG-TAC
Зонд: TQ-pesti 5’-FAM-TGC-YAY-GTG-GAC-GAG-GGC-ATG-C-TAMRA-3’
d) Приготовление реакционных смесей
Реакционные смеси для ПЦР готовят в отдельном помещении, которое изолировано от других помещений, где проводят ПЦР и работают с пробой. Для каждого теста ПЦР необходимо включить соответствующие контроли. Как минимум необходимо включить контроль без матрицы (NTC), соответствующий отрицательный контроль (NC), два положительных контроля (PC1, C2). Положительные и отрицательные контроли включены на всех этапах анализа, начиная с экстрагирования, тогда как контроль без матрицы добавляют после завершения экстрагирования. Амплификации ПЦР выполняют в объеме 25 мкл. Описанный протокол основан на использовании системы на основе 96 луночного микропланшета, но другие варианты с использованием микропробирок тоже возможны. Каждая лунка планшета ПЦР должна содержать 20 мкл реакционной смеси и 5 мкл образца:
125 мкл 2× RT буфер из коммерческого набора
1 мкл ВД КРС 190-F прямой праймер (20 мкМ)
1 мкл V326 Обратный праймер (20 мкМ)
1 мкл TQ-pesti зонд (3 мкМ)
|
|
|
2 мкл тРНК (40 нг/мкл)
1, 5 мкл вода
1 мкл 25× ферментная смесь
5 мкл образец (или контроли NTC, NC, PC1, PC2)
e) Выбор контролей
NTC: Обычно состоит из тРНК в воде без нуклеазы, которую добавляют вместо образца, когда устанавливают реакцию ПЦР.
NC: На практике многие лаборатории используют фосфатно-буферный раствор с желатином или подобный буфер. В идеале контролями для тестирования образцов спермы должна быть отрицательная сперма от серо-негативных быков. Однако, как минимум, используемый анализ должен быть всесторонне валидирован с отрицательными и положительными результатами для подтверждения того, что он обеспечивает надежное экстрагирование и амплификацию с использованием спермы.
PCs: Существует два положительных контроля (PC1=умеренный – (Ct 29-32) и PC2=слабый (Ct 32-35). В качестве положительного контроля предпочтительнее использовать положительную сыворотку от естественно инфицированных быков. Однако, вероятно, ее трудно получить. Также сперму от персистентно инфицированного быка не считают подходящей, потому что вирусная нагрузка обычно очень высокая, и она не даст надежных показателей любого умеренного снижения в экстрагировании или рабочих характеристиках анализа. Отрицательная сперма, с добавлением определенных количеств вируса ВД КРС может быть использована в качестве альтернативы. Если другие образцы используются в качестве рутинного РС, весь процесс экстрагирования и используемый анализ ПЦР, как минимум, должны быть валидированы с использованием положительной спермы от быков с PTI или от быков в стадии острой инфекции. Если эти образцы недоступны и используются пробы с добавками с целью валидации, необходимо включить несколько проб с добавлением очень низкого уровня вируса. Включение эгзогенного контроля с каждым исследуемым образцом на ежедневной основе значительно компенсирует неиспользование положительной спермы в качестве контроля и даст дополнительные преимущества благодаря мониторингу анализа, проведенного на каждом отдельном образце. Положительные контрольные образцы необходимо готовить с осторожностью во избежание перекрестной контаминации от расплодки вируса с высоким титром и их нужно готовить заранее и замораживать в концентрации «годен к использованию» и в идеале в объеме для одноразового использования.
f) Экстрагированные образцы добавляют к миксу для ПЦР в отдельном помещении. Контроли нужно добавлять в последнюю очередь, в следующем порядке: NTC, отрицательный контроль и затем два положительных контроля.
g) Полимеразная цепная реакция в реальном времени
Планшет или пробирки для ПЦР помещают в систему обнаружения ПЦРв реаьном времени в отдельном помещении, предназначенном для проведения ПЦР. Многие мастермиксы имеют универсальные условия для реакции, которые подходят разным анализам. Например, система обнаружения ПЦР запрограммирована проводить исследование следующим образом:
|
|
|
1× 48°С 10 минут
1× 95°С 10 минут
45× (95°С 15и секунд, 60°С 1 минута)
h) Анализ данных, полученных в результате ПЦР в реальном времени
Программное обеспечение обычно установлено на автоматическую корректировку результатов посредством введения поправки на любой фоновый сигнал, и пороговый уровень устанавливается обычно в соответствии с инструкциями производителя для программного обеспечения, используемого для проведения анализа. В данном случае пороговое значение установлено на 0, 05.
i) Интерпретация результатов
a) Исследуемые контроли – все контроли должны давать ожидаемые результаты, положительные контроли PC1 и PC2 должны находиться в назначенном диапазоне и как отрицательный контроль NC, так и контроль без матрицы NTC не должны иметь значения Ct.
b) Исследуемые образцы
1) Положительный результат: любой образец, который показывает пороговую величину цикла (Ct) менее 40 считается положительным.
2) Отрицательный результат: Любой образец, который не показывает величину Ct, считается отрицательным. Однако перед тем, как сообщить об отрицательных результатах исследования необходимо проверить характеристики эгзогенного внутреннего контроля и результаты должны находиться в рамках утвержденного диапазона для данного контроля (например, Ct величина – не более чем на 2-3 Ct единицы выше чем NTC).
1. 3. Твердофазный иммуноферментный анализ для обнаружения антигена
Обнаружение антигена с использованием ИФА стало широко распространенным методом для обнаружения отдельных персистентно инфицированных животных. Эти анализы не предназначены для обнаружения животных, инфицированных в острой форме (однако время от времени это можно достигнуть). Важно, что эти анализы не предназначены для скрининга спермы или биологических материалов, используемых в анализах или производстве вакцины. Были опубликованы несколько методов ИФА для обнаружения антигена и в продаже имеется несколько наборов. Многие основаны на принципе сандвич-ИФА с захватом антигена, связанного с твердой фазой и на детекторном антителе, конъюгированном с сигнальной системой, например пероксидазой. Этапы амплификации, такие как использование биотина и стрептавидина в системе обнаружения иногда используются для повышения чувствительности анализа. Описаны как
моноклональные, так и поликлональные системы. Тест измеряет антиген ВД КРС (NS2-3 или ERNS) в лизатах лейкоцитов периферийной крови; новое поколение методов ИФА с захватом антигена (ИФА с захватом ERNS) способно обнаруживать антиген ВД КРС в крови и в плазме или образцах сыворотки. Наилучший метод дает чувствительность схожую с выделением вируса, может быть предпочтительным в тех редких случаях, когда персистирующая инфекция сопровождается серопозитивностью. Из-за переходной виремии ИФА для обнаружения антигена менее полезен для обнаружения антигена при острых инфекция ВД КРС.
ИФА для обнаружения NS2-3 может быть менее эффективным у телят, которые получали молозиво из-за присутствия материнских антител к ВВД КРС. ОТ-ПЦР в реальном времени является наиболее чувствительным методом обнаружения при данных обстоятельствах, но ИФА для обнаружения ERNS показал себя как чувствительный и надежный тест, особенно при использовании на образцах биопсии кожи (выщип на ухе) (Cornish et al., 2005).
1. 4. Иммуногистохимия
Методы с использованием компонентов, меченых ферментами, являются полезными для обнаружения антигена ВВД КРС в срезах тканей, особенно в тех случаях, когда доступны подходящие моноклональные антитела (MAbs). Однако эти анализы не подходят для сертификации животных для международной торговли и их использование должно быть ограничено диагностическими исследованиями. Важно, чтобы используемые реактивы и процедуры были полностью валидированными и чтобы неспицифичная реактивность была устранена. Для персистентно инфицированного КРС может использоваться почти любая ткань, но имеется особенно успешный опыт использования лимфатических узлов, щитовидной железы, кожи, мозга, сычуга и плаценты. Биопсии кожи, такие как образцы выщипа уха, были полезны для диагностики in vivo персистентной инфекции ВД КРС.
|
|
|
