2. Серологические тесты. 2.1. Реакция нейтрализации вируса. 2.1.1. Процедура тестирования

2. Серологические тесты

Антитела к ВВД КРС могут быть обнаружены в сыворотке КРС стандартным методом вируснейтрализации или ИФА с использованием одного из опубликованных методов или коммерческих наборов (например, Edwards, 1990). Серология используется для идентификации уровней иммунитета популяции, для обнаружения персистентно инфицированных животных в стаде, для содействия расследованию болезней репродуктивной системы и возможного участия ВВД КРС и установления серологического статуса быков, используемых для отбора спермы и идентификации инфекции, которая имела место недавно. При помощи ИФА для обнаружения антигена в образцах сборного молока можно установить статус стада по ВД КРС, что является очень полезным (Niskannen, 1993). Высокий показатель ИФА (0, 8 или более единиц абсорбции) в ревакцинированном стаде означает высокую вероятность того, что стадо было подвергнуто контакту с ВВД КРС в недавнем прошлом, вероятнее всего, из-за наличия одного или двух персистентно виремичных животных. Напротив, очень низкое отрицательное значение (≤ 0, 2) показывает, что вероятнее всего персистентно виремические животные отсутствуют. Однако значения ИФА не всегда являются надежным индикатором наличия персистентно инфицированных животных на ферме, ввиду разных систем содержания животных (Zimmer et al., 2002), недавнего введения вакцины или наличия вирусного антигена в сборном молоке, что может помешать анализу на обнаружение антител. Определение статуса антител у небольшого молодого поголовья (9-18 месяцев) также использовалось в качестве индикатора недавней передачи ВВД КРС

в стаде (Houe et al., 1995), но данный метод так же зависит от степени контакта между различными группами животных в стаде и потенциального контакта с соседними стадами. Реакции вируснейтрализации более часто используются для выполнения регулярных задач (например, тестирование доноров спермы), тогда как ИФА (обычно в виде коммерческих наборов) обычно используется для диагностики. Независимо от того, проводится ИФА или реакция вируснейтрализации, в каждый тест необходимо включить положительную и отрицательную стандартную сыворотку. Она должна показать результаты в предустановленных пределах для того, чтобы тест, считался обоснованным. В реакции вируснейтрализации в каждый исследуемый образец нужно также включить «сывороточный контроль» для мониторинга токсичности образца.

2. 1. Реакция нейтрализации вируса

Выбор штамма вируса для включения в реакцию нейтрализации вируса является очень важным. Не существует ни одного штамма, который был бы идеальным для всех условий, но на практике нужно выбирать тот штамм, который обнаруживает высокое соотношение серологических реакций в местной популяции КРС. Есть возможность, что низкие уровни антител к ВВД КРС типа 2 не смогут быть обнаружены с использованием реакции нейтрализации вируса, в которой используется штамм вируса 1го типа и наоборот (Fulton et al., 1997). Важно использовать в тесте типы 1 и 2 ВВД КРС, и те только тот, который присутствует по предположению диагноста, так как это может привести к недостаточной информации по тесту. Большинство лабораторий используют для реакции нейтрализации вируса высоко цитопатические, адаптированные к лаборатории штаммы ВВД КРС, так как в этом случае результаты теста гораздо легче прочитать. Два широко-используемых цитопатических штамма – «Oregon C24V» и «NADL». Однако в настоящее время доступны методы иммунных меток, позволяющие без затруднений обнаружить рост или нейтрализовать нецитопатические штаммы, когда это является желательным, особенно для поддержания включения актуального для данной местности штамма вируса. Внизу представлен протокол реакции нейтрализации вируса с использованием микропланшета (Edwards, 1990).

2. 1. 1. Процедура тестирования

i) Исследуемую сыворотку инактивируют при высокой температуре 56°С в течение 30 минут.

ii) Начиная с ¼ исходного разведения готовят серийные двукратные разведения тестовой сыворотки в 96-луночном микротитровальном планшете с плоским дном для клеточной культуры, используя среду клеточной культуры в качестве разбавителя. Для каждого образца используют три или четыре лунки в каждом разведении в зависимости от степени требуемой точности. В каждом разведении сыворотки оставляют одну лунку для каждого образца без вируса для контроля доказательств токсичности образца, которая может имитировать вирусную цитопатологию или мешать репликации вируса. Контрольные положительная и отрицательная сыворотки должны также быть включены в каждую партию тестов.

iii) В каждую лунку добавляют равный объем (например 50 мкл) расплодки цитопатического штамма ВВД КРС, содержащего 100 ТЦД 50 (50%), дозу инфицирующую культуру тканей. Обратное титрование вирусной расплодки также проводится в нескольких свободных лунках для проверки иммуногенности вируса (приемлемые пределы 30-300 ТЦД 50.

 iv) Планшет инкубируют в течение 1 часа при температуре 37°С.  

v) Плашку с подходящими клетками (например, носовая раковина, бычий семенник) трипсинизируют и концентрацию клеток доводят до 1, 5× 105/мл. 100 мкл клеточной суспензии добавляют в каждую лунку микротитровального планшета.

vi) Планшет инкубируют в течение 4-5 дней при температуре 37°С либо в 5% атмосфере СО2, либо в герметично закрытом планшете.

vii) Лунки исследуют под микроскопом на ЦПД или фиксируют или окрашивают иммунопероксидазным окрашиванием с использованием соответствующего моноклонального антитела. Титр нейтрализации вируса для каждой сыворотки это разведение, при котором вирус нейтрализуется в 50% лунок. Это можно подсчитать при помощи методов Спирмена-Кербера и Рида Мюнха. Серонегативные животные продемонстрируют отсутствие нейтрализации в самом низком разведении (1/4), эквивалентном конечному разведению 1/8. Для точного сравнения титров антител и особенно для демонстрации значительных (больше четырехкратных) изменений в титре, образцы необходимо исследовать параллельно в том же тесте.