2.2. Твердофазный иммуноферментный анализ

Могут использоваться как непрямой, так и блокирующий метод. В продаже имеются коммерческие наборы. Подобно реакции нейтрализации вируса, методы ИФА, измененные с использованием антигена от одного генотипа ВД, не могут обнаружить антитело, индуцированное другим антителом. Тесты, таким образом, нужно выбирать по их способности обнаруживать антитело к спектру генотипов и штаммам, циркулирующим в стране, где проводится тест.

Главная трудность в постановке теста заключается в приготовлении вирусного антигена достаточной иммуногенности. Вирус можно вырастить в оптимальных условиях культивирования с использованием высоко пермиссивных клеток. Любая сыворотка, используемая в среде не должна ингибировать рост ВВД КРС. Оптимальное время для сбора урожая должно быть определено экспериментальным путем для определенной системы культивирования. Вирус может быть концентрирован и очищен посредством центрифугирования в градиенте плотности. В качестве альтернативы иммуногенный антиген можно приготовить посредством обработки указанных клеточных культур моющими средствами, такими как Nonidet P40,  N-деканоил-N-метилглюкамин (Mega 10), Triton X-100 или 1–октилбета-D- глюкопиранозид (OGP). Некоторые специалисты использовали зафиксированные, инфицированные целые клетки в качестве антигена. В будущем можно будет наблюдать повышенное использование искусственных антигенов, полученных в результате экспрессии специфичных вирусных генов в бактериальных или эукариотических системах. Такие системы должны быть валидированы посредством тестирования сыворотки, специфичной для широкого диапазона различных штаммов вируса. В будущем данная технология должна позволить производить серологические тесты в дополнение к субъединичным или маркерным вакцинам, таким образом, позволяя дифференцировать вакцинированный и естественно инфицированный КРС. Далее представлен краткий протокол непрямого ИФА (Edwards, 1990).

 2. 2. 1. Процедура тестирования

i) Культуры роллерного типа вторичных клеток телячьих семенников с высокой множественностью заражения (около одной) инокулируют штаммом ВВД КРС Oregon C24V, покрывают средой без сыворотки и инкубируют в течение 24 часов при температуре 37°С.

ii) Клетки собирают и осаждают центрифугированием. Среду супернатанта выбрасывают. Осадок обрабатывают двумя объемами 2% OGP в ФБР в течение 15 минут при температуре 4°С и центрифугируют для удаления клеточного осадка. Антиген супернатанта хранят маленькими аликвотами при температуре -70°С или лиофилизируют. Неинфицированные клетки обрабатывают параллельно для получения контрольного антигена.

iii) Антиген разводят до получения предустановленного разведения в 0, 05 М бикарбонатного буфера, рН 9, 6. Чередующиеся ряды микротитровального планшета для ИФА сенсибилизируют вирусом и контрольными антигенами в течение ночи при температуре 4°С. Затем планшеты моют в ФБР 0, 05 Твин 20 и Твин 80 (ФСБТ) перед использованием в тесте.

iv) Тестовую сыворотку разводят 1/50 в разбавителе сыворотки (0, 5 М NaCl; 0, 01M фосфатного буфера; 0, 05 % Твин 20; 0, 01 М этилен-диамин-тетрауксусной кислоты; 1% поливинилпирролидона, рН 7, 2) и добавляют в лунки, сенсибилизированные вирусом и контролем на один час при температуре 37°С. Затем планшеты промывают пять раз в ФСБТ.

v) Конъюгат кроличьих антибовиных IgG с пероксидазой добавляют в предустановленном разведении (в разбавители сыворотки) на 1час при температуре 37°С, затем планшеты еще раз моют в ФСБТ).

vi) Добавляют подходящий ферментный субстрат, такой как перекись водорода/тетраметил бензидин. После появления окрашивания реакцию останавливают серной кислотой и абсорбцию читают с использованием ИФА ридера. Коэффициент, полученный с контрольным антигеном, вычитают из реакции теста, чтобы получить удельный коэффициент поглощения для каждой сыворотки.

vii) Рекомендуется пересчитывать удельный коэффициент поглощения для образца: положительный коэффициент (или процентная положительность) делением удельного поглощения на значение удельного коэффициента поглощения в данном тесте стандартной положительной сыворотки, которая имеет удельный коэффициент поглощения равный 1, 0. Данная процедура нормализации приводит к более стабильным и воспроизводимым результатам.

С. ТРЕБОВАНИЯ К ВАКЦИНАМ

1. Обоснование

Вакцины против ВВД КРС используются в первую очередь для контроля болезни, хотя они могут давать преимущества при производстве, особенно КРС в интенсивных системах содержания, таких как откормочные

площадки. В некоторых странах, где предпринимаются действия по искоренению ВВД КРС персистентно инфицированных животных удаляют, а оставшийся КРС вакцинируют для поддержания высокого уровня инфицирования и предотвращения возникновения персистентно инфицированных животных. Проведение вакцинации для контроля инфекции ВВД КРС может быть трудным частично из-за антигенного разнообразия вируса и возникновения персистирующих инфекций, которые развиваются в результате фетальной инфекции. Продолжающееся сохранение вируса в природе в основном поддерживается персистентно инфицированными животными, которые являются результатом внутриутробной инфекции. Цель применения вакцины должна состоять в предотвращении системной виремии и попадания вируса в плаценту. Если это можно успешно достичь, то вероятно применение вакцины сможет предотвратить большой диапазон других клинических проявлений, включая репродуктивные, респираторные и кишечные болезни и иммуносупрессию с ее вторичными осложнениями. В различных странах имеется несколько вакцин. Традиционно вакцины против ВВД КРС делятся на два класса: модифицированные живые вирусвакцины и инактивированные вакцины. Были описаны экспериментальные рекомбинантные субъединичные вакцины, основанные на вирусном гликопротеине ВД КРС Е2, экспрессированном баколовирусом или трансгенными растениями и ДНК вакцины против Е2 ВВД КРС, но только незначительное количество имеется в продаже, если вообще имеется. Они предлагают дальнейшие перспективы для маркерных вакцин при использовании вместе с дополнительным серологическим тестом.