Определение нитратредуктазы

а) Суточную агаровую культуру засевают в 1 мл бульона Хоттингера с 0,1 % азотно-кислого калия. После 2-х суток инкубации при температуре (37,0 ± 0,5) °С в посевы добавляют 0,5 мл реактива Грисса. В положительных случаях среда сразу же окрашивается в красный цвет.

б) К 1—2-суточной культуре в бульоне Хоттингера с 0,1 % KNO₃ добавляют 3—5 капель реактива, представляющего собой смесь равных объемов 0,1 %-го раствора риванола в дистиллированной воде и 12 %-го раствора соляной кислоты. В случае положительной реакции бульон окрашивается в красный цвет.

Определение β-галактозидазы

Суточную агаровую культуру засевают на скошенную поверхность агара, содержащего 10 % лактозы. Посевы инкубируют 1—2 суток при температуре (37 ± 0,5) °C. Петлю выросшей культуры суспендируют в 0,25 мл 0,9 %-го раствора натрия хлорида, добавляют 0,25 мл водного раствора О-нитрофенил-b-D-галактопиранозита (ONPG) и помещают в термостат при (37 ± 0,5) °C. Реакцию учитывают через 20 мин, 1, 3 и 24 ч. В положительном случае взвесь приобретает желтую окраску, отрицательном – остается бесцветной.

6.6. Оценка эпидемической значимости холерных вибрионов

6.6.1. Определение гемолитической активности (по Грейгу)

К 1 мл 18—24-часовой культуры, выращенной в 4—5 мл мясо-пептонного бульона добавляют 1 мл 1 %-й взвеси трижды отмытых эритроцитов барана в физиологическом растворе. Смесь бульонной культуры и эритроцитов осторожно перемешивают встряхиванием и помещают на 2 ч в термостат при температуре (37,0 ± 0,5) °С, а затем в холодильник до следующего дня. Предварительный учет результатов проводят через 2 ч, окончательный – на следующий день. При положительной реакции наступает полный или частичный лизис эритроцитов (лаковая кровь). В контроле (1 мл бульона + 1 мл взвеси эритроцитов) гемолиз отсутствует. Чистоту опыта следует контролировать путем высева «смеси» на агаровую среду.

Для постановки пробы Грейга может быть использована дефибринированная кровь барана, консервированная борной кислотой или консервантом Алсевера. Консервированные эритроциты сохраняют свои свойства в течение 3-х месяцев. Перед постановкой пробы на гемолиз дефибринированную кровь центрифугируют при 2—3 тыс. об./мин в течение 15 мин, надосадочную жидкость удаляют, а осевшие эритроциты отмывают 0,9 %-м раствором хлорида натрия 2—3 раза с промежуточным центрифугированием до получения прозрачной надосадочной жидкости. Из отмытых эритроцитов приготавливают 1 %-ю взвесь в 0,9 %-м растворе хлорида натрия, которую можно хранить при температуре 4 °С 2—3 дня и использовать для постановки пробы Грейга описанным выше способом (рецепты консервантов см. раздел 7).

6.6.2. Определение эпидзначимости холерных вибрионов
эльтор комплексным методом – по отношению к диагностическим
холерным бактериофагам эльтор ctx⁺ и ctx^– в соответствии с наставлением к препаратам и гемолитической активности

Методика определения гемолитической активности описана выше.

Для постановки пробы с фагом используют метод агаровых слоев. Испытуемую культуру в объеме 0,5 мл добавляют пипеткой в пробирку с 5,0 мл 0,5—0,7 %-го агара Мартена pH 7,6 ± 0,2, расплавленного и охлажденного до 45 °С. После перемешивания все содержимое выливают на подсушенную поверхность агара Мартена pH 7,6 ± 0,2 в чашку Петри. После застывания слоя агара с культурой на его поверхность наносят цельные фаги эльтор ctx⁺ и ctx^–. После высыхания капель фагов чашки переворачивают агаром вверх и инкубируют при температуре (37,0 ± 0,5) °С.

По лизису фагами и гемолитической активности в пробе Грейга (табл. 6) исследуемые штаммы относят к эпидемически опасным (I груп­па, вариант 1), эпидемически неопасным (III группа, варианты 6, 7, 8) или требующим дополнительных исследований для заключения об их эпидзначимости (группа II, варианты 2, 3, 4, 5).

Таблица 6

Схема оценки эпидемической значимости V. cholerae eltor
по чувствительности к бактериофагам ctx⁺ и ctx^- и
гемолитической активности

6.6.3. Определение токсигенности холерных вибрионов
на модели кроликов-сосунков

Исследования проводят в лабораториях, имеющих разрешение на экспериментальную работу с микроорганизмами I—II групп патогенности.

Для заражения животных используют 4-часовую агаровую культуру, выращенную при температуре (37,0 ± 0,5) °С или 18-часовую – при температуре (20,0 ± 1,0) °С. Необходимо использовать две заражающие дозы: 1 ´ 10⁵ и 1 ´ 10⁷ м.к., которые вводят внутрикишечно в объеме по 0,2 мл двум кроликам. Заражающую дозу контролируют путем высева на две чашки щелочного агара 0,1 мл взвеси из разведения 1 ´ 10³ м.к./мл. Кроликов 10—12-дневных, массой 130—160 г, фиксируют к станку брюшком вверх, выстригают шерсть на операционном поле и смазывают его йодом. Дают эфирный или внутримышечно тиопенталовый наркоз (0,2 мл 1 %-го раствора на 100 г массы). Делают разрез длиною 1 см по средней линии живота на уpовне пупка. Извлекают петлю тонкого кишечника на длинной брыжейке, фиксируют с помощью мягкого пинцета и вводят взвесь вибpионов. Петлю погружают в брюшную полость, брюшную стенку и кожу послойно зашивают. Шов смазывают йодом. Опеpиpованных крольчат кормят с помощью шприца молоком и наблюдают 48 ч. Всех погибших и умерщвленных через 48 ч животных вскрывают и делают высев содержимого кишечника на чашки щелочного агара. Наиболее выраженные изменения наблюдаются в толстом кишечнике, который растянут бесцветной или светло-желтой пpозpачной или слегка опалесциpующей жидкостью. Слепая кишка и прилегающие отделы толстого кишечника могут быть настолько растянуты, что сквозь них видны подлежащие петли кишечника, что создает видимость полной пpозpачности кишечного содержимого. Тонкий кишечник pасшиpен и также заполнен полупpозpачным содеpжимым. Описанные изменения хаpактеpны для «синдpома холеpогенности», наблюдаемого при заражении эпидемически опасными, содержащими ген холерного токсина штаммами.

Токсигенные (содержащие ген холерного токсина) штаммы холерных вибрионов вызывают гибель большинства заpаженных животных дозами 1 ´ 10⁵ и 1 ´ 10⁷ м.к. в течение пеpвых двух суток с описанным выше типичным «синдpомом холеpогенности».

Штаммы холерных вибрионов, не содержащие гена холерного токсина, как правило, не вызывают гибели животных и изменений в кишечнике или обусловливают накопление в кишечнике выживших или единичных павших животных мутной, бесцветной или коричневато-жёлтой жидкости, т. е. развитие энтеропатогенного синдрома, связанного с реализацией других факторов патогенности.

Обязательной проверке на модели кpоликов-сосунков при отсутствии возможности определения эпидзначимости другими методами подлежат следующие штаммы V. cholerae О1 и О139 серогрупп.

а) Выделенные от людей:

· гемолизнегативные штаммы холерных вибрионов О139 серогруппы;

· гемолизпозитивные штаммы холерных вибрионов обеих серогрупп;

· гемолизнегативные штаммы холерных вибрионов О1 серогруппы, атипичные по серологическим свойствам и устойчивые к фагам эльтор и ctx⁺.

б) Выделенные из объектов окружающей среды:

· гемолизотрицательные штаммы холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп, выделенные при отсутствии эпидосложнений по холере.

6.6.4. Определение генов холерного токсина (ctx АВ)
 и токсинкорегулируемых пилей (tcp A)