 |
Определение вибриоцидных антител (ВА) в сыворотке крови на основе ферментации углеводов
|
|
|
|
Об отсутствии или наличии ВА судят по ферментации сахарозы, регистрируемой с помощью индикатора.
Материалы и оборудование:
· инактивированная сыворотка крови;
· штаммы холерного вибриона серовара Огава и Инаба;
· комплемент, разведенный 1: 20 1 %-й пептонной водой, содержащей 1 % сахарозы и 1 % индикатора Андреде;
· термостат на (37,0 ± 1) °С.
Методика постановки реакции
Комплемент, разведенный 1: 20 1 %-й пептонной водой с сахарозой и индикатором Андреде разливают в пробирки по 0,45 мл. В первую пробирку добавляют 0,05 мл исследуемой сыворотки и после тщательного перемешивания переносят 0,05 мл смеси во вторую пробирку, из второй в третью и т. д. (до разведения 10–5—10–9). Готовят суспензию 18—20-часовой агаровой культуры холерного вибриона и разводят 1 %-й пептонной водой до концентрации 103 м.к./мл. Во все пробирки вносят по 0,45 мл суспензии и помещают в термостат.
Постановку реакции сопровождают следующими контролями:
· 0,45 мл 1 %-й пептонной воды, содержащей 1 % сахарозы и 1 % индикатора Андреде + 0,05 мл исследуемой сыворотки + 0,45 мл взвеси культуры – контроль сыворотки;
· 0,45 мл комплемента с сахарозой и индикатором + 0,45 мл культуры – контроль комплемента;
· 0,45 мл 1 %-й пептонной воды с сахарозой и индикатором + 0,45 мл культуры – контроль культуры;
· 0,45 мл 1 %-й пептонной воды с сахарозой и индикатором + 0,05 мл исследуемой сыворотки – контроль стерильности сыворотки.
Через 5—6 ч проводят учет реакции. При этом в контроле (кроме контроля стерильности сыворотки) цвет содержимого пробирок должен перейти в красный или розовый. Изменение цвета индикатора в пробирках рабочего ряда, связанное с ферментацией сахарозы размножившимися вибрионами, свидетельствует об отсутствии вибриоцидных антител в исследуемой сыворотке. За вибриоцидный титр принимают то наибольшее разведение сыворотки, при котором цвет содержимого пробирок остается неизмененным или интенсивность его значительно отличается от окраски контрольных проб. Результат выражают в виде десятичного логарифма разведения сыворотки, взятого с обратным знаком.
|
|
|
Примечание. Для постановки РВА при холере, обусловленной холерным вибрионом О139 серогруппы, не может быть использован выделенный в очаге штамм в связи с возможной чувствительностью его к комплементу. В этих случаях рекомендуется предложенный специалистами Ростовского НИПЧИ, ctx– клон холерного вибриона О139, направленный на депонирование в Государственную коллекцию патогенных бактерий «Микроб» (РосНИПЧИ «Микроб»).
8.3. Определение токсиннейтрализующих антител
в сыворотке крови
Для выявления токсиннейтрализующих антител в сыворотке крови больных холерой и вибриононосителей предназначена РНГА с эритроцитарным холерным энтеротоксическим диагностикумом (ЭХЭД), у которых инфицирование обусловлено холерными вибрионами О1 и О139 серогрупп. Токсиннейтрализующие антитела появляются на 5—7-й день болезни, достигая максимума на 14—21-й день, затем их титр постепенно снижается, но сохраняется дольше других антител. Иммуноглобулины к холерному токсину, в сравнении с вибриоцидными и другими специфическими холерными антителами, дольше циркулируют в сыворотке крови после перенесенной инфекции (до 8—10 и более месяцев). Условно положительным титром РНГА с ЭХЭД следует считать 1: 160 и выше. Целесообразно исследовать парные сыворотки.
Результат РНГА с ЭХЭД позволяет сделать заключение о токсигенности (эпидемичности) циркулирующего в очаге штамма холерного вибриона, в том числе и без выделения культуры.
Приложение 1
(рекомендуемое)
Направление проб от людей
|
|
|
в лабораторию __________________________________________
для исследования на ______________________________________
от «____» ____________200__ г.
| № регистрационный * | № пробы | Первичная или повторная | Характер материала | Фамилия, И., О. | Возраст | Диагноз | Адрес места жительства | Место работы | Время отбора пробы | Примечание** |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 |
* Регистрационный номер проставляют в лаборатории.
** Указать принимал (а) ли антибиотики; если да, то какие, когда и сколько.
Пробы отбирали:_____________________________________________
____________________________________________________
____________________________________________________
(Фамилия, И., О., должность) (Подписи)
Пробы доставил _____________________________________________
(Фамилия, И., О., должность) (Подписи)
Время доставки проб__________________________________________
(дата, время – часы, минуты)
Приложение 2
(рекомендуемое)
Направление проб из объектов окружающей среды
в лабораторию ______________________________________________
для исследования на __________________________________________
от «_____» __________________200___ г.
| № регистрационный * | № пробы | Место отбора проб | Объект для исследования | Характер материала | Объем (количество) | Время отбора пробы (ч, мин) |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
* Регистрационный номер проставляют в лаборатории.
Пробы отбирали:_____________________________________________
___________________________________________________________
___________________________________________________________
(Фамилия, И., О., должность) (Подписи)
Пробы доставил _____________________________________________
(Фамилия, И., О., должность) (Подписи)
Время доставки проб__________________________________________
(дата, время – часы, минуты)
Приложение 3
(обязательное)
Укладка
для отбора материала от больного с подозрением на холеру для больничного учреждения неинфекционного профиля, станций скорой и неотложной помощи, поликлиник, СКО, СКП, ПСКП
|
| ||
| 1. | Банки широкогорлые с крышками или притертыми пробками, емкостью не менее 100 мл | 2 шт. |
| 2. | Контейнеры 100—200 мл с завинчивающейся крышкой стерильные, полипропиленовые | 2 шт. |
| 3. | Стеклянные трубки с резиновой грушей для переноса жидкого исследуемого материала в контейнеры | 2 шт. |
| 4. | Контейнеры для испражнений 30 мл с ложкой, полипропиленовые | 2 шт. |
| 5. | Пробирки с ватными тампонами или алюминиевыми петлями (стерильные) | 2 шт. |
| 6. | Клеенка медицинская подкладная | 1 м |
| 7. | Полиэтиленовые пакеты | 5 шт. |
| 8. | Салфетки марлевые | 5 шт. |
| 9. | Направление на анализ (бланк) | 3 шт. |
| 10. | Лейкопластырь | 1 уп. |
| 11. | Карандаш простой | 1 шт. |
| 12. | Карандаш по стеклу | 1 шт. |
| 13. | Бикс (металлический контейнер) | 1 шт. |
| 14. | Инструкция по забору материала | 1 шт. |
| 15. | Хлорамин в пакетах по 30 г, рассчитанный на приготовление 1 литра 3 %-го раствора | 1 шт. |
| 16. | Хлорная известь сухая в пакете из расчета 200 г на 1 кг выделений | 1 шт. |
| 17. | Перчатки резиновые | 2 пары |
| 18. | Емкость эмалированная 10 л | 1 шт. |
| 19. | Пептонная вода 1 %-я во флаконах по 50 мл, закрытых резиновыми пробками и завальцованных металлическими колпачками | 4 шт. |
| 20. | Флаконы с 50 мл 0,9 %-го раствора хлорида натрия, закрытые резиновыми пробками и завальцованные металлическими колпачками | 2 шт. |
|
|
|
|
|
|
Приложение 4
(обязательное)
Укладка
для забора проб из объектов окружающей среды на холеру
| 1. | Ящик тарный на 20 гнезд | 1 шт. |
| 2. | Ящик металлический – укладка | 1 шт. |
| 3. | Бутылки 0,5 л с ватно-марлевыми (и резиновыми) пробками, с пергаментными бумажными колпачками | 20 шт. |
| 4. | Флаконы с 50 мл 0,9 %-го раствора натрия хлорида, закрытые резиновыми пробками и завальцованные металлическими колпачками | 2 шт. |
| 5. | Спирт 96 ° | 100 мл |
| 6. | Вата | 100 г |
| 7. | Карандаш по стеклу | 2 шт. |
| 8. | Карандаш простой | 1 шт. |
| 9. | Бумага писчая | 10 листов |
| 10. | Направление на анализ (бланк) | 10 шт. |
| 11. | Бумага копировальная | 5 листов |
| 12. | Пинцет | 1шт. |
| 13. | Банка 0,5 л с матерчатыми салфетками (15 шт.) для отбора проб сточных вод | 1 шт. |
| 14. | Термометр до 50 °С | 1 шт. |
| 15. | Бумага индикаторная для определения pH (1—12) | 1 упак. |
| 16. | Банка с притертой крышкой с ватными тампонами | 1 шт. |
| 17. | Пробирки с тампонами для взятия смывов | 20 шт. |
| 18. | Штатив на 20 гнезд | 1 шт. |
| 19. | Батометр | 1 шт. |
| 20. | Шпагат – мотки по 5, 10 и 30 м | 45 м |
| 21. | Хлорамин в пакетах по 30 г, рассчитанный на приготовление 1 литра 3 %-го раствора | 2 шт. |
| 22. | Емкость на 1 л для приготовления 3 %-го хлорамина | 1 шт. |
| 23. | Пакеты полиэтиленовые | 5 шт. |
| 24. | Халат медицинский и шапочка | 2 шт. |
| 25. | Перчатки резиновые | 2 пары |
| 26. | Фартук и нарукавники клеенчатые | 1 шт. |
Приложение 5
(рекомендуемое)
|
|
|
Способ отбора колоний вибрионов с помощью стереоскопического микроскопа в косо проходящем свете
Принцип метода заключается в том, что при просмотре колоний различных микробов под малым увеличением микроскопа или лупы при освещении их пучком света, косо падающим на поверхность агара, колонии приобретают способность светиться и кажутся окрашенными.
К стереоскопическому микроскопу МБС-2 или МБС-1 приспосабливают устройство для получения узкого пучка света и зеркало от микроскопа на подвижном шарнире для освещения чашки снизу под углом 45—50°.
Чашки с посевами просматривают после 12—18 ч инкубации. При величине угла падения луча света к поверхности агара в 40—50° колонии вибрионов по своей окраске заметно отличаются от других микроорганизмов.
Цвет колоний, выросших на щелочном агаре, при косом освещении:
| Микроорганизмы | Цвет колонии |
| Холерные вибрионы | Преобладает серо-голубой с оттенком зеленовато-серым, синевато-зеленым, реже – зеленый с верхним краем красно-бурого или коричневого оттенка |
| Сальмонеллы | Розовый оттенок |
| Шигеллы | Розовый с фиолетовым оттенком |
| Кишечная палочка | Ярко-красный |
| Протей | Красный с фиолетовым оттенком |
Приспособления для просмотра колоний в косо проходящем свете.
1. Столик стереоскопического микроскопа МБС-1 или МБС-2 заменяют специальным приспособлением для освещения чашки снизу под углом 45—50°. Источником света служит осветитель от микроскопа, на который надевают кожух с отверстием диаметром 5 мм против спирали лампочки для получения узкого пучка света. Узкий пучок света направляют в центр вогнутого зеркала, которое перемещается на подвижном шарнире поворотом винта в зависимости от необходимого угла падения света. Угол вычисляют по соотношению расстояния от зеркала до чашки, которое меняется произвольно, и расстояния от чашки до поверхности стола, остающегося неизменным.
Для удобства исследования осветитель и зеркало можно вмонтировать в ящик со стеклянной крышкой, на которую помещают чашку с посевом. Это дает возможность быстро находить нужный угол падения света, передвигая зеркало поворотом винта по вмонтированной шкале.
2. Приспособление, смонтированное из основных узлов стереоскопического микроскопа БМС-1 и прибора для счета колоний.
Из раструба верхней крышки прибора для подсчета колоний удалить оба стекла вместе с упорным кольцом и снять верхнюю крышку. Из скобы передней панели вывинтить вертикальную ось, после чего убрать диск со светофильтрами. Освободить два винта, прикрепляющие патрон лампочки освещения к кронштейну на задней панели. В крышку снизу вставить вертикальную штангу от узла лупы с таким расчетом, чтобы в рабочем положении прибора муфта с прижимным винтом оказалась на дне под кронштейном импульсного счетчика. В муфту зажать держатель с угловыми губками (из комплекта лабораторного штатива), предварительно укороченный до 110 мм. Держателем закрепить патрон с лампочкой в вертикальном положении. Крышку фиксировать винтами на своем обычном месте.
Штатив микроскопа МБС-1 вместе с бинокулярной насадкой отсоединить от столика и установить непосредственно на корпус прибора для счета колоний так, чтобы 3 сферических ножки основания штатива охватили раструб крышки прибора, а окно основания было обращено к наблюдателю. Подлежащие к просмотру чашки с посевами устанавливают над открытым окном. Нужную освещенность и угол падения света находят изменением положения лампы, которое достигается поворотом штанги, после чего последнюю фиксируют цанговым зажимом.
Приложение 6
(рекомендуемое)
Журнал
регистрации микробиологических исследований материала
от больных (трупов) людей с подозрением на холеру и другие карантинные инфекции
| № регистрационный | Фамилия, И., О. | Возраст | Пол | Место работы, должность | Место жительства (адрес) | Клинический (патолого-анатомический) диагноз | Учреждение, направляющее пробу | Цель исследования | №, дата первичного анализа (год, месяц, число) | Применение антибиотиков | Дата и время | Исследуемый материал | Результаты исследования | Дата направления ответа (месяц, число) | Подпись врача | |
| взятия пробы (год, месяц, число, час) | приема анализа (месяц, число, час) | |||||||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 |
Приложение 7
(рекомендуемое)
Журнал
регистрации микробиологических исследований проб
из объектов окружающей среды
| № регистрационный | Объект исследования | Адрес, место отбора проб | Количество (объем) пробы | Наименование учреждения, | Дата и время | Результат исследования | Подпись | ||
| отбора пробы (год, месяц, число, час) | приема пробы (месяц, число, час) | выдачи ответа (месяц, число, час) | |||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
Приложение 8
(рекомендуемое)
Журнал
идентификации культур холерных вибрионов
| № регистрационный | № штамма | Вид микроба | Дата выделения (число, | Объект исследования | Морфология клетки | Подвижность | Морфология колоний | Индофенолоксидаза | Лизиндекарбоксилаза | Орнитиндекарбоксилаза | Аргининдигидролаза | Расщепление глюкозы в среде Хью-Лейфсона | Ферментация | ||||||
| сахарозы | арабинозы | маннозы | маннита | инозита | |||||||||||||||
| аэробное | анаэробное | ||||||||||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | |
Продолжение журнала
| Ферментация | Образование | Взаимодействие с | Чувствительность | Реакция гемагглютинации | Чувствительность к полимиксину В 50 ед./мл | Гемолитическая активность в пробе Грейга | ||||||||||||||
| лактозы | крахмала | желатины | индола | сероводорода | ацетилметилкарбинола | агглютинации | РНГА, РТПГА | МФА | классическому | эльтор | ctx+ | ctx- | ТЭПВ 1—7 | |||||||
| О1 | Огава | Инаба | РО | О139 | ||||||||||||||||
| 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 |
Продолжение журнала
| Токсигенность | ПЦР | ДНК-зондировние на ctx АВ | Чувствительность к антибиотикам | Заключение* | Подпись врача | ||||||||||||||
| диско-диффузионный метод | метод серийных | ||||||||||||||||||
| на кроликах- | тетрациклин | левомицетин | доксициклин | ципрофлоксацин | нитрофурантин | ко-тримоксазол | другие (вписать) | тетрациклин | левомицетин | доксициклин | ципрофлоксацин | нитрофурантоин | ко-тримоксазол | ||||||
| сtx АВ | tcp A | ||||||||||||||||||
| 41 | 42 | 43 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 | 49 | 50 | 51 | 52 | 53 | 54 | 55 | 56 | 57 | 58 | 59 | |
Примечание: *
– таксономическое определение токсигенность с указанием метода определения, чувствительности к антибиотикам (значения МПК, мкг/м);
– при необходимости дифференциации от других видов патогенных вибрионов добавляют тесты: рост без NaCl; расщепление салицина, дульцита, целлобиозы, тест на b-галактозидазу, наличие нитратредуктазы.
Приложение 9
(обязательное)
|
|
(форма № 513/у)
| № п/п | № анализа | Адрес и дата взятия пробы | Наименование ПБА* | № штамма | Источник выделения | Дата выделения | Краткая характеристика ПБА** | Судьба ПБА*** | Примечание |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
* Патогенный биологический агент.
** Типичность; при атипичности указать отличительные признаки.
*** Уничтожен (дата, № акта); передан в коллекцию, центр и т. д. (дата, № акта)
Приложение 10
(обязательное)
Паспорт штамма
Вид микроба___________________________ Штамм № ____________
Ф., И., О.__________________________________ возраст ___________
место жительства больного или вибриононосителя (подчеркнуть) _____
___________________________________________________________
(республика, область, район, населенный пункт, улица, №№ дома и квартиры)
Наименование объекта _______________________________________
(река, озеро, и т. п.)
наименование стационарной точки ______________________________
(зона сан. охраны, место сброса
сточных вод и т. п.),
сточные воды _______________________________________________
(в очаге, коллектор, очистные сооружения
до или после очистки и т. п.),
другие объекты ______________________________________________
(указать)
с указанием территории _______________________________________
(республика, область, район, населенный пункт)
Дата забора материала ______________ Дата выделения культуры
Культуру выделил (а) _________________________________________
(Ф., И., О. врача, учреждение)
Культуру подтвердил (а) ______________________________________
(Ф., И., О. врача, учреждение)
Характеристика штамма
1. Морфология клеток ________________________________________
Тинкториальные свойства _____________________________________
2. Подвижность ______________________________________________
3. Культуральные свойства: на 1 % п.в. __________________________
на щелочном агаре ___________________________________________
4. Проба на оксидазу _________________________________________
5. Лизиндекарбоксилаза _______________________________________
орнитиндекарбоксилаза _____________ аргининдигидролаза ________
6. Расщепление: глюкозы в среде Хью-Лейфсона (аэробн./анаэробн.)___
сахарозы ______, маннозы ______, арабинозы _______, маннита_____,
инозита______________, лактозы_______________, крахмала _______
7. Протеолитическая активность ________________________________
8. Агглютинабельность холерными сыворотками (указать серии и титр сывороток):
О1 ___________________, Огава ___________________, Инаба _____,
РО _______________________________, О139 ___________________
9. Реакция с холерными О1 люминесцирующими антителами ________
10. Чувствительность к холерным фагам: классическому ________,
эльтор _____________________________________________________,
ctx+____________, ctx– ________________, ТЭПВ (1—7) ____________
11. Гемолитическая активность по Грейгу ________________________
12. Реакция гемагглютинации __________________________________
13. Чувствительность к полимиксину В 50 (ед/мл)___________________
14. Токсигенность:
комплексным методом (ctx фаги и гемолиз) ________________________
на кроликах-сосунках ________________________________________
ПЦР _______________________________________________________
ДНК-зондирование ___________________________________________
15. Антибиотикограмма
| № | Препарат | Значение | Результат | |||
| МПК, мкг/мл | зона ингибиции роста, мм | чувствительный | промежуточный | устойчивый | ||
| 1 | Доксициклин | |||||
| 2 | Тетрациклин | |||||
| 3 | Левомицетин | |||||
| 4 | Ципрофлоксацин | |||||
| 5 | Рифампицин | |||||
| 6 | Нитрофурантоин | |||||
| 7 | Ко-тримоксазол | |||||
| 8 | Гентамицин | |||||
| 9 | Ампициллин | |||||
| 10 | Цефотаксим | |||||
| Другие (вписать) | ||||||
16. Другие свойства___________________________________________
17. Среда хранения __________________________________________
Подпись врача __________________________________________
Примечание.
1) В графе 8 указывать: отр. или до титра; 1/2 титра и т. д.
2) В графе 10 указывать: до титра; 1/2 титра и т. д.
|
|
|
