 |
Б. Контроль катионного состава
|
|
|
|
Для получения воспроизводимых результатов оценки антибиотикорезистентности питательная среда должна содержать Са2+ 20—25 мг/л и Mg2+ 10,0—12,5 мг/л.
Наиболее доступным интегральным методом оценки качества сред (как жидких, так и агаризованных) является сопоставление экспериментально полученной величины МПК референтных штаммов микроорганизмов с этим показателем, приведенным в их паспортной характеристике.
Наиболее подходящим штаммом для оценки качества жидких и плотных питательных сред, предназначенных для изучения антибиотикорезистентности, является штамм Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Среду следует считать удовлетворительной по качеству, если величина МПК гентамицина находится в пределах 0,5—2,0 мкг/мл. Выбор гентамицина для контроля качества связан с тем, что аминогликозидные антибиотики наиболее чувствительны к колебаниям концентрации двухвалентных катионов.
В. Для контроля на наличие антагонистов сульфаниламидных препаратов и триметоприма рекомендуется использовать штамм Enterococcus faecalis ATCC 29212. При величине МПК триметоприма/сульфаметоксазола <0,5/9,5 мкг/мл среду следует признать удовлетворительной по качеству.
Определение величины МПК антибиотиков (или диаметров зон ингибиции роста) в отношении референтных штаммов в целях контроля качества среды проводят в соответствии с описанными выше методами. Категорическим требованием является использование антибиотиков с предварительно известной активностью.
Таблица 10
Значения величин МПК (мкг/мл) для референтных штаммов
| Антибиотики | E. faecalis ATCC 29212 | E. coli ATCC 25922 | P. aeruginosa ATCC 27853 |
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| Ампициллин | 0,5–2,0 | 2—8 | – |
| Цефтибутен | – | 0,12—0,50 | – |
| Цефотаксим | – | 0,03—0,12 | 8—32 |
| Цефтриаксон | – | 0,03—0,12 | 8—32 |
| Налидиксовая кислота | – | 1—4 | – |
| Норфлоксацин | 2—8 | 0,03—0,12 | 1—4 |
| Ципрофлоксацин | 0,25—2,00 | 0,004—0,015 | 0,25—1,00 |
| Офлоксацин | 1—4 | 0,015—0,120 | 1—8 |
| Ломефлоксацин | 2—8 | 0,03—0,12 | 1—4 |
| Амикацин | 64—256 | 0,5—4,0 | 1—4 |
| Гентамицин | 4—16 | 0,25—1,00 | 0,5—2,0 |
| Нетилмицин | 4—16 | <0,5—1,0 | 0,5—8,0 |
| Тобрамицин | 8—32 | 0,25—1,00 | 0,25—1,00 |
| Канамицин | 16—64 | 1—4 | – |
| Хлорамфеникол | 4—16 | 2—8 | – |
|
|
|
| Продолжение табл. 10 | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| Тетрациклин | 8—32 | 0,5—2,0 | 8—32 |
| Рифампин | 0,5—4,0 | 4—16 | 16—64 |
| Нитрофурантоин | 4—16 | 4—16 | – |
| Ко-тримоксазол (1/19) | <0,5/9,5 | <0,5/9,5 | 8/152—32/608 |
| Примечание: данные приведены для методов серийных разведений в бульоне | |||
Таблица 11
Значения величин диаметров зон ингибиции роста (мм)
для референтных штаммов
| Антибиотики | Содержание в диске, мкг | E. coli ATCC 25922 | S. aureus ATCC 25923 | P. aeruginosa ATCC 27853 |
| Ампициллин | 10 | 16—22 | 27—35 | – |
| Цефтибутен | 30 | 27—35 | – | – |
| Цефотаксим | 30 | 29—35 | 25—31 | – |
| Цефтриаксон | 30 | 29—35 | 22—28 | 17—23 |
| Налидиксовая к-та | 30 | 22—28 | – | – |
| Норфлоксацин | 10 | 28—35 | 17—28 | 22—29 |
| Ципрофлоксацин | 5 | 30—40 | 22—30 | 25—33 |
| Офлоксацин | 5 | 29—33 | 24—28 | 17—21 |
| Ломефлоксацин | 10 | 27—33 | 23—29 | 22—28 |
| Амикацин | 30 | 19—26 | 20—26 | 18—26 |
| Гентамицин | 10 | 19—26 | 19—27 | 16—21 |
| Нетилмицин | 30 | 22—30 | 22—31 | 17—23 |
| Тобрамицин | 10 | 18—26 | 19—29 | 19—25 |
| Канамицин | 30 | 17—25 | 19—26 | – |
| Хлорамфеникол | 30 | 21—27 | 19—26 | – |
| Тетрациклин | 30 | 18—25 | 24—30 | – |
| Доксициклин | 30 | 18—24 | 23—29 | – |
| Рифампин | 5 | 8—10 | 26—34 | – |
| Нитрофурантоин | 300 | 20—25 | 18—22 | – |
| Ко-тримпоксазол (1/19) | 1,25/23,75 | 24—32 | 24—32 | – |
7. Питательные среды, реактивы, консерванты.
Порядок контроля качества питательных сред
7.1. Питательные среды
Транспортные среды:
1 %-я пептонная вода, pH 8,5 ± 0,1 без ингибиторов роста сопутствующей флоры и с теллуритом калия (см. среды обогащения);
2 %-й раствор поваренной соли: 20 г хлорида натрия и 0,1 г едкого натрия растворяют в 1 л дистиллированной воды; жидкость пропускают через бумажный фильтр, разливают по 10 мл в пробирки и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 0,7 атм.
|
|
|
Среды обогащения
а) Основной раствор пептона готовят по следующей прописи:
Пептон сухой – 100,0
Натрия хлорид – 50,0
Калия нитрат – 10,0
Натрия карбонат – 25,0
Дистиллированная вода – 1 л
pH 8,4 ± 0,1.
В холодную дистиллированную воду погружают пептон, хлорид и карбонат натрия. Смесь кипятят при постоянном помешивании до полного растворения пептона, не допуская его пригорания, затем добавляют нитрат калия. Проверяют реакцию среды, если нужно, pH доводят до 8,5 ± 0,1. Раствор фильтруют через миткалевый или бумажный фильтр, разливают в посуду и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1 атм.
Основной раствор пептона сохраняется до 2 лет.
б) 1 %-я пептонная вода.
Для получения 1 %-й пептонной воды концентрированный раствор разводят в 10 раз дистиллированной водой. После установления pH 8,5 ± 0,1 разливают в пробирки или во флаконы и стерилизуют 20 мин при давлении 0,7 атм.
Можно готовить 1 %-ю пептонную воду и непосредственно из отдельных компонентов, взяв навески в 10 раз меньше указанных в рецепте основного пептона. Технология приготовления такая же, как и основного пептона.
в) Пептонная вода с теллуритом калия.
В 1 %-ю пептонную воду (pH 8,5 ± 0,1) после автоклавирования добавляют теллурит калия в конечном разведении 1: 100 000 или 1: 200 000. Предварительно готовят рабочий 0,1 %-й раствор теллурита калия(1: 1 000). Срок хранения рабочих растворов 7 дней.
Плотные среды для выделения холерных вибрионов
Щелочной мясо-пептонный агар:
Мясная вода – 1 л
Пептон – 10,0
Натрия хлорид – 5,0
Агар-агар – 20,0
pH 8,0 ± 0,2.
В мясную воду вносят пептон и хлорид натрия. Смесь перемешивают и подщелачивают 20 %-м раствором едкого натра до pH 8,3 ± 0,1. Затем добавляют агар-агар и содержимое помещают в автоклав для варки среды вначале текучим паром в течение 30—40 мин, а затем при 1 атм 20 мин. Если мясо-пептонный агар варят на плите, среду кипятят до полного расплавления агар-агара при постоянном помешивании.
|
|
|
Для получения прозрачной агаровой среды ее после варки с целью отстоя на 2—3 ч оставляют в автоклаве или помещают в термостатную комнату при температуре (43 ± 2) °С, лучше время отстоя продлить до 18—20 ч. Отстоявшийся агар осторожно, не взбалтывая, сливают с осадка на плотный ватно-марлевый фильтр. В фильтрате уточняют реакцию среды, если требуется, подкисляют её, но подщелачивать агар на данном этапе не рекомендуется во избежание выпадения осадка при стерилизации готовой среды. Профильтрованный агар разливают в посуду и стерилизуют при 1,0 атм 20 мин.
Элективные среды
Рекомендуется использовать питательную среду для выделения холерных вибрионов элективно-дифференциальную, сухую (СЭДХ).
Среда обладает выраженными элективными свойствами, обеспечивая ингибицию сопутствующей микрофлоры (энтеробактерий, протея, кокков и др.) и практически не влияет на рост вибрионов. Холерные вибрионы О1 и не О1 групп через 12—18 ч формируют на этих средах плоские, прозрачные колонии желтого цвета за счет ферментации сахарозы, диаметром 1,0—2,0 мм; V. parahaemolyticus – мелкие, голубоватые (цвета среды) с уплотненным центром; V. alqinolyticus – крупные, желтые; колонии Pseudomonas, Aeromonas – голубые, Enterobacteriaceae – очень мелкие, плотные или полупрозрачные, иногда окрашены в желтый цвет; колонии протея, как правило, не роятся.
|
|
|
