А. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Методом ПЦР проводят определение генов холерного токсина (ctx АВ) и токсинкорегулируемых пилей (tcp А).

В основе ПЦР лежит амплификация (умножение) участка генома, ограниченного парой специфических праймеров, путем многократного копирования при помощи фермента – термостабильной ДНК-полиме­разы (Taq-полимеразы). Образование в результате реакции фрагментов ДНК ожидаемого размера свидетельствует о наличии в пробе специфической ДНК.

Материал для исследования. Материалом для исследования может быть клинический материал (испражнения, рвотные массы), объекты окружающей среды (вода поверхностных водоемов, смывы с поверхностей, стоки, ил), чистые культуры вибрионов, I и II среда накопления. Первичную подготовку, обеззараживание материала и выделение ДНК проводят в соответствии с МУ 1.3.1794—03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I—II групп патогенности».

Подготовка проб для ПЦР. Подлежащие исследованию пробы испражнений или рвотных масс в объеме 1 мл (1 г) помещают в стерильные флаконы и добавляют 0,9 мл 0,9 %-го раствора натрия хлорида, суспендируют встряхиванием и отстаивают в течение 10 мин. Затем для отделения крупных частиц центрифугируют в течение 3 мин при 5 000 g (об/мин). Надосадочную жидкость центрифугируют в течение 15 мин при 12 000 g (об/мин), после чего осадок ресуспендируют в 100 мкл дистиллированной воды. Подготовленную таким образом пробу обеззараживают.

Воду из поверхностных водоемов (стоки) центрифугируют в полном объёме (1 л) в центрифужных стаканах ёмкостью 250 мл в течение 15 мин при 12 000 g (об/мин.). Осадок ресуспендируют в 1 000 мкл или 1,5—2,0 мл дистиллированной воды. Пробы обеззараживают.

Подозрительные колонии и чистые культуры, выросшие на плотных питательных средах, суспендируют в 50 мкл дистиллированной воды в микропробирке объемом 1,5 мл, доводя концентрацию до 5 единиц по стандартному образцу мутности (ОСО 42-28-59-86П), что соответствует 1 ´ 10⁹ м.к./мл для вибрионов. Затем готовят 10-кратные разведения взвесей в дистиллированной воде до необходимой концентрации с учетом чувствительности используемой ПЦР-тест-системы и обеззараживают.

При исследовании сред накопления их центрифугируют в течение 15 мин при 12 000 g (об/мин). Осадок ресуспендируют в 100 мкл дистиллированной воды и обеззараживают.

Обеззараживание проб. Все пробы обеззараживают путем кипячения в течение 30 мин, что обеспечивает инактивацию культур холерных вибрионов согласно пункту 2.8.16 СП 1.3.1285—03.

Выделение ДНК. Из подготовленных и обеззараженных таким образом проб проводят выделение ДНК с помощью сертифицированных наборов для выделения ДНК и согласно прилагаемой к набору инструкции. При исследовании чистых культур этап выделения ДНК опускают, для постановки ПЦР используют обеззараженные кипячением бактериальные взвеси.

Постановка ПЦР. Для постановки ПЦР используют разрешенные комитетом МИБП к применению в практике здравоохранения ПЦР-тест-системы. Работу выполняют согласно прилагаемой к тест-системе инструкции. Амплификацию проводят на программируемых термоциклерах отечественного и зарубежного производства.

Учет результатов ПЦР. Для учета результатов ПЦР используют электрофорез в агарозном или полиакриламидном геле. Условия проведения электрофореза, визуализации результатов и их учет отражены в инструкциях к ПЦР-тест-системам.

При этом следует обратить внимание на следующие моменты:

· если в положительном контроле отсутствует специфическая полоса (ошибка в постановке реакции, неправильное хранение или загрязнение реактивов в процессе работы, сбой программы амплификатора) – требуется повторная постановка реакции;

· если в отрицательном контроле выявляется специфическая полоса на уровне положительного контроля (контаминация реактивов положительной ДНК или продуктами амплификации) – необходимо поставить дополнительные отрицательные контроли на этапе постановки ПЦР. Если результат повторяется – необходимо сменить реактивы.

Наличие полос ампликонов, располагающихся выше или ниже контрольной полосы, является неспецифическим ответом, и результат реакции оценивается как отрицательный.

6.7. Оценка антибиотикочувствительности

Для оценки антибиотикочувствительности холерного вибриона используют диско-диффузионный метод и методы серийных разведений в агаре и бульоне.

Методы и критерии оценки антибиотикочувствительности холерного вибриона разработаны и стандартизованы для указанных методов и ограниченного перечня антибиотиков: ампициллина, тетрациклина, доксициклина, ко-тримоксазола, хлорамфеникола.

Для оценки чувствительности холерного вибриона к другим антибиотикам, прежде всего к фторхинолонам, временно предлагается использовать методы и критерии оценки, разработанные для микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae. В пользу возможности такого допущения говорит тот факт, что методы и критерии, разработанные для перечисленных выше антибиотиков, полностью совпадают с таковыми для семейства Enterobacteriacеae.

В международной практике основной средой, используемой во всех методах оценки антибиотикочувствительности, является среда Mueller-Hinton (агар и бульон). Рассматриваемые в последующих разделах критерии величины МПК, позволяющие отнести исследуемые микроорганизмы к одной из категорий: «чувствительные», «устойчивые» или «промежуточные», разработаны именно для среды Mueller-Hinton.

Следует признать возможность использования для оценки антибиотикочувствительности и других сред (например, АГВ) в том случае, если они удовлетворяют требованиям, изложенным в разделе 6.7.3. Контроль качества питательных сред для определения антибиотикочувствительности с учётом соответствующих требований проводят в лабораториях учреждений, имеющих необходимые для этого референтные штаммы микроорганизмов. Указанные учреждения ежегодно информируют курируемые лаборатории о возможности использования для этих целей конкретных питательных сред с указанием номера серий и даты выпуска или снабжают их готовыми партиями сред.

6.7.1. Методы серийных разведений

Постановка методов серийных разведений для оценки антибиотикочувствительности включает следующие этапы:

· приготовление растворов антибиотиков;

· приготовление питательных сред с антибиотиками;

· приготовление суспензии исследуемого микроорганизма, ее стандартизация и инокуляция;

· инкубация;

· учет и интерпретация результатов.

Общим и крайне важным этапом для всех методов серийных разведений является приготовление растворов антибиотиков.