 |
А) Для определения образования индола
|
|
|
|
Реактив Эрлиха:
Парадиметиламинобензальдегид – 1,0 г
Этиловый спирт – 95,0 мл
Концентрированная соляная кислота – 20,0 мл
Альдегид растворяют в спирте, затем добавляют кислоту, смешивают, хранят в темном месте.
Полоски фильтровальной бумаги пропитывают насыщенным раствором щавелевой кислоты и высушивают в термостате.
Б) Для выявления образования сероводорода
Полоски фильтровальной бумаги пропитывают раствором уксусно-кислого свинца. Подсушивают на воздухе.
Полоски индикаторных бумажек на индол и сероводород помещают под пробку пробирки с засеянной культурой. В случае образования индола полоска краснеет, а при образовании сероводорода полоска чернеет.
В) Для определения нитратредуктазы
Готовят отдельно два раствора. Первый – путем растворения при нагревании в фарфоровой ступке в 20 мл дистиллированной воды 0,2 мг альфа-нафтиламина (С10Н7NН2). Жидкость осторожно вливают в 150 мл 12 %-го раствора уксусной кислоты. Второй – 0,5 г сульфаниловой кислоты (С6Н4NН2S03Н) растворяют в 150 мл 12 %-й уксусной кислоты.
Затем оба раствора сливают в темную склянку с хорошо притертой пробкой. Реактив Грисса должен быть бесцветным, если он розовеет, то им не пользуются.
Сложность приготовления реактива Грисса, дефицитность и токсичность входящих в него компонентов (в частности, альфа-нафтиламина) ограничивают возможности его применения. Этих недостатков лишен метод с использованием риванолового реактива, представляющего собой смесь равных объемов 0,1 %-го раствора риванола в дистиллированной воде и 12 %-го раствора соляной кислоты. В случае положительной реакции культура испытуемого штамма, выращенная в бульоне или 1 %-й пептонной воде с 0,1 %-м KNО3, окрашивается в красный цвет.
|
|
|
г) Для определения β-галактозидазной активности приготавливают М/75 раствор орто-нитрафенил – β-Д-галактопиранозида (ОНФГ):
ОНФГ – 80 мг
Дистиллированная вода – 75 мл
Фосфатный буфер – 5 мл
Растворяют в дистиллированной воде при 37 °С ОНФГ, затем добавляют раствор однозамещенного фосфорно-кислого натрия (NaН2РО4 × Н2О). Доводят pН до 7,0. Раствор должен быть бесцветным – хранят при температуре –4 °С. Перед использованием раствор выдерживают в течение нескольких минут до растворения фосфата, который на холоде кристаллизируется.
7.3. Консерванты для сохранения дефибринированной крови
А) Консервант с борной кислотой
Борная кислота – 40,0 г
Глюкоза – 50,0 г
0,9 %-й раствор натрия хлорида – до 1 л
Стерилизуют на водяной бане или текучим паром при 100 °С – по 20 мин в течение 3-х дней.
Соединяют 100 мл дефибринированной крови барана с 15 мл консерванта с борной кислотой.
Б) Консервант Алсевера
Сахароза (или глюкоза) – 20,5
Хлористый натрий – 8,0
Цитрат натрия – 4,2
Дистиллированная вода – до 1,0 л
pН – 6,1 доводится 10 %-м раствором лимонной кислоты.
Стерилизуют на водяной бане или текучим паром при температуре 100 °С по 20 мин в течение 3-х дней.
Консервант Алсевера и дефибринированную кровь соединяют поровну. Консервированную кровь хранят при температуре (4 ± 1) °С.
7.4. Порядок контроля качества питательных сред
Питательные среды, консерванты, ингибиторы посторонней микрофлоры, используемые в диагностике холеры, подлежат обязательной проверке в соответствии с действующими инструктивно-методическими документами.
|
|
|
Бактериологический контроль качества плотных и жидких питательных сред могут проводить лаборатории противочумных и других учреждений, имеющие разрешение на работу с возбудителем холеры, применяя для контроля тест-штаммы Vibrio cholerae P-1 (145) и Vibrio cholerae eltor M-878, а также лаборатории особо опасных инфекций учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, с использованием тест-штамма авирулентного холерного вибриона не О1 серогруппы Р-9741 в порядке, определяемом действующими методическими указаниями по контролю питательных сред.
Бактериологическому контролю подлежит каждая серия сухой среды производственного выпуска, имеющая номер государственной регистрации, лицензии на ее производство и соответствующий срок годности, а также среды лабораторного изготовления.
На контроль направляют часть общего объема среды, предназначенного для проведения исследований, в количестве 200 мл агара и 100 мл основного раствора пептона производственного выпуска и в двойном объеме для серий лабораторного изготовления. В направлении следует указать название среды, предприятие-изготовитель, номер серии и срок годности сухой среды, дату контролируемой варки. Транспортируемые образцы должны быть надежно упакованы, флаконы с жидкой средой закрыты резиновыми пробками.
Оптимальный срок проверки питательной среды 10—14 дней после приготовления.
При положительном результате контроля пробы соответствующая серия сухой среды считается пригодной к использованию. Последующий контроль этой серии среды осуществляется ежегодно, а также при изменении условий приготовления сухой среды, независимо от времени предыдущей проверки.
Если при первом контроле среда оказалась непригодной, необходим повторный бактериологический контроль этой же серии сухой среды, при этом на контроль необходимо направлять образец новой варки и навеску сухой среды этой же серии.
При получении отрицательного результата повторного контроля среды, приготовленной на месте, и положительного бактериологического контроля образца этой же серии сухой среды, сваренного в лаборатории контролирующего учреждения, следует считать пригодной данную серию сухой питательной среды и принять меры к выяснению и устранению ошибки в технологии местного изготовления.
|
|
|
При получении отрицательного результата на образец сухой среды данной серии направляют рекламацию в адрес учреждения-изготовителя и ГИСК им. Л. А. Тарасевича.
Сроки хранения щелочного агара и основного раствора пептона производственного выпуска (сухая среда и приготовленные из неё образцы) указаны в инструкции предприятия-изготовителя по применению среды.
Для сред лабораторного изготовления определены следующие сроки хранения:
· для щелочного агара – 6 месяцев с момента изготовления и первичного контроля, по истечении этого срока допускается переконтроль и продление срока годности ещё на 3 месяца;
· для основного раствора пептона – 2 года с контролем качества среды после приготовления, затем спустя 1,0—1,5 года хранения.
Срок хранения 1 %-й пептонной воды при герметичной упаковке (резиновые пробки и металлические колпачки) – 2 месяца, а после переконтроля возможно продление срока хранения на 1 месяц.
Питательные среды, готовые к употреблению, хранят в тёмном прохладном месте (6—20 °С), не допуская перепада температур больше чем на 5 °С. Подъем и снижение температур губительно действуют на биологические свойства сред.
Щелочной агар и основной пептон, контролируемые авирулентным тест-штаммом холерного вибриона, подлежат периодической перепроверке по согласованию с территориальными лабораториями и противочумными учреждениями на базе последних вирулентными тест-штаммами. Ежегодному контролю в территориальном противочумном учреждении подлежит также теллурит калия.
8. Методы серологической диагностики
Серологические методы исследования, как правило, имеют дополнительное значение, и лишь в отдельных случаях при проведении оперативного и ретроспективного эпидемиологического анализа их результаты могут быть решающими.
|
|
|
Для серологической диагностики холеры используют иммунологические реакции, выявляющие в сыворотке крови больных, переболевших и вибриононосителей, а также вакцинированных специфические антитела: агглютинины, антитоксины и вибриоцидные антитела.
У больных холерой на 5—7-й день от начала заболевания появляются агглютинины, вибриоцидные антитела и антитоксины.
Целесообразно исследовать парные сыворотки с интервалом в 7—10 дней. Первая проба должна быть взята на 5—7-й день для оперативной диагностики и вторая – через 7—10 дней и более – для ретроспективной.
Кровь для серологических исследований берут из вены, а при отсутствии такой возможности – из пальца. Из вены берут 1—5 мл крови, после свертывания сгусток отслаивают от стенки пробирки стерильной стеклянной палочкой или платиновой петлей. Пробирки сохраняют в холодильнике и транспортируют в лабораторию охлажденными (в термосе, сумке-холодильнике и др.). В лаборатории сыворотку инактивируют при температуре (56,0 ± 0,5) °С 30 мин.
Если кровь забирают в день постановки реакции, пробирки со свернувшейся кровью необходимо центрифугировать 10—15 мин при 3 000 об./мин. При отсутствии возможности исследовать сыворотку немедленно, ее сохраняют в ампулах при температуре (4,0 ± 0,5) °С. Кровь из пальца берут в объеме 0,4 мл и вносят в стерильный пенициллиновый флакон или пробирку с 1,6 мл 0,9 %-го раствора хлорида натрия (1: 5).
8.1. Определение аглютининов в сыворотке крови
А. Обнаружение противохолерных антител методом развернутой реакции агглютинации. Исследуемую сыворотку разводят 1 %-й пептонной водой рН 7,5 ± 0,1 в объеме 1 мл от 1: 10 до 1: 640. В качестве антигена используют 3-часовую бульонную культуру, выделенную в данном очаге, или исследуют в 3-х рядах с культурами холерных вибрионов (сероваров Огава, Инаба и О139 серогруппы). В пробирку с раститрованной сывороткой вносят по 1 капле культуры-антигена и ставят на 1 ч в термостат, затем до утра в холодильник при температуре (4,0 ± 0,5) °С, после чего отмечают результаты. Реакция сопровождается контролями антигена и сыворотки.
При определении титра реакции учитывают разведения с агглютинацией на 3—4 креста.
Результат исследования сыворотки больного при реакции агглютинации в разведении 1: 40 и выше считается ориентировочно положительным.
Диагностическое значение имеет не менее чем 4-кратное нарастание титров антител.
|
|
|
