 |
Среды для идентификации вибрионов
|
|
|
|
а) Среды с углеводами для отбора колоний:
Среда Ресселя
Пептон – 5,0
Натрия хлорид – 5,0
Лактоза – 10,0
Глюкоза – 1,0
Агар-агар – 10,0
Индикатор Андреде – 40 мл
Вода дистиллированная – 1 л
pH 7,3 ± 0,1.
Среду варят, фильтруют, разливают по 5—7 мл в стерильные пробирки и стерилизуют при давлении 0,5 атм 20 мин. Готовую среду после стерилизации скашивают так, чтобы получить столбик и косяк. Среда светлая.
Среду можно готовить на 1,0—1,3 %-м питательном агаре, добавляя к нему в соответствующих концентрациях углеводы и индикатор Андреде.
Лактозо-сахарозная среда
Готовится как и среда Ресселя, но вместо глюкозы берут сахарозу в том же количестве.
Среда Клиглера:
1,5—1,7 %-й мясопептонный агар или другой слабощелочной
питательный агар – 1 л
Лактоза – 10,0
Глюкоза – 1,0
2 %-й раствор серно-кислого
закисного железа – 10,0 мл
0,8 %-й раствор тиосульфата натрия – 10,0 мл
0,4 %-й раствор сульфата натрия – 10,0 мл
1 %-й раствор фенолового красного – 24,0 мл
pH 7,3 ± 0,1.
Вначале в расплавленном питательном агаре (pH 7,7 ± 0,1) растворяют углеводы, затем к нему добавляют свежеприготовленные растворы железа и солей натрия согласно прописи среды (индикатор на сероводород). Кроме того, для регистрации кислотообразования добавляют индикатор феноловый красный. Среду варят, фильтруют, разливают по 5—7 мл в стерильные пробирки, стерилизуют 20 мин при давлении 0,5 атм и скашивают по типу среды Ресселя; pH готовой среды 7,3 ± 0,1; цвет красный.
|
|
|
Маннозо-сахарозная среда
1,5 %-й питательный агар – 1 л
Манноза – 1,0
Сахароза – 10,0
Серно-кислое железо (FeSO4) – 0,2
Гипосульфит натрия (Na2SO3 × 5H2O) – 0,08
Сульфит натрия (Na2SO3) – 0,4
0,2 %-й феноловый красный – 10,0
После расплавления pH среды довести до 8,0, разлить в пробирки по 5—7 мл и стерилизовать при 0,7 атм 15 мин. Готовую среду после стерилизации скашивают так, чтобы получить столбик и косяк.
б) Среды для идентификации.
Среды Гисса
К 100 мл 1 %-й пептонной воды (pH 7,3 ± 0,1) без селитры добавляют 0,5—1,0 % необходимого углевода или спирта (L-арабиноза, D-манноза, D-сахароза, D-маннит, L-инозит, D-глюкоза, растворимый крахмал и др.) и 1 % индикатора Андреде или 0,1 мл 1,6 %-го раствора бромтимолового синего. Среды разливают в стерильные пробирки с поплавками и стерилизуют при 0,5 атм 20 мин; среду с L-арабинозой следует стерилизовать в течение 20 мин при 0,1—0,2 атм. Для приготовления сред Гисса можно применять только перечисленные изомеры углеводов. Готовые среды Гисса с индикатором Андреде светлые, при кислотообразовании краснеют. Среды с бромтимоловым синим зеленого цвета с травянистым оттенком, при кислой реакции – жёлтого цвета, при щелочной – синего.
Среда Хью-Лейфсона
Пептон – 2,0
Натрия хлорид – 5,0
|
|
|
Двузамещённый фосфат калия – 0,3
Глюкоза – 10,0
Бромтимоловый синий – 0,03
Агар-агар – 3,0
Дистиллированная вода – 1 л
pH 7,1 ± 0,1.
К воде добавляют пептон, натрия хлорид и агар-агар. Смесь подогревают до расплавления агара, затем вносят фосфат калия и глюкозу, продолжают кипятить 2—3 мин. Смесь подщелачивают 20 %-м раствором едкого натрия до pH 7,4 ± 0,1, доводят объем среды до первоначального и добавляют 3 мл 1 %-го водного раствора бромтимолового синего. Затем среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по 4—5 мл в стерильные пробирки и стерилизуют при давлении 0,5 атм 20 мин. Цвет среды до стерилизации синий, а после автоклавирования травянисто-зеленый, pH 7,1 ± 0,1. При кислой реакции среда желтеет.
Бульон Кларка
Пептон – 5,0
Глюкоза – 5,0
Двузамещенный фосфат калия – 5,0
Дистиллированная вода – 1 л
Смесь ингредиентов нагревают до полного их растворения, затем фильтруют через бумажный фильтр и разливают по 5 мл в стерильные пробирки. Бульон стерилизуют при давлении 0,5 атм 20 мин.
Среда Кодама. В 1 %-ю пептонную воду добавляют 0,5 % растворимого крахмала. Среду разливают в стерильные пробирки и стерилизуют 20 мин под давлением 0,5 атм. Для оценки результатов расщепления крахмала используют реактив Люголя.
Среда с желатиной. К мясопептонному бульону или бульону Хоттингера прибавляют мелко нарезанную желатину из расчета 10,0—15,0 г на 100 мл (летом концентрацию желатины увеличивают до 20 %). Желатине дают набухать в течение 30 мин и затем растворяют при медленном нагревании в водяной бане при температуре (45,0 ± 5,0) °С. Устанавливают pH 7,1 ± 0,1, прибавляя к расплавленной желатине 10 %-й раствор двууглекислого натрия. При более щелочной реакции желатина застывает плохо, а иногда и совсем не застывает. В 1 л растворенной желатины вносят для просветления два взбитых с небольшим количеством дистиллированной воды яичных белка. Смесь перемешивают и прогревают текучим паром в течение 20 мин до полного свертывания белка и просветления среды. Затем среду фильтруют в горячем состоянии через бумажный или ватно-марлевый фильтр с большой поверхностью. Среду, разлитую по 5—8 мл в пробирки, стерилизуют при давлении 0,5 атм 20 мин. После стерилизации среду охлаждают путем погружения пробирок в холодную воду в строго вертикальном положении, чтобы верхняя часть столбика при застывании оставалась совершенно ровной.
|
|
|
Среда для определения декарбоксилаз и дигидролаз аминокислот
Пептон – 5,0
Дрожжевой экстракт – 25,0 (сухой 3,0)
Глюкоза – 1,0
Натрия хлорид – 5,0
Натрия карбонат – 0,1
Бромтимоловый синий
(0,1 %-й раствор в 20 %-м спирте) – 45,0 (0,045 г сухого)
Аминокислота – 10,0—20,0
Дистиллированная вода – 1 л
pH 6,4 ± 0,1.
Все ингредиенты по прописи вышеуказанной среды растворяют при нагревании, устанавливают pH 6,4 ± 0,1, затем добавляют соответствующий индикатор и делят среду на 4 равные части. В одну часть аминокислоты не добавляют, эта порция служит контролем. В остальные порции вносят соответственно: в первую — 1 % лизина, во вторую – 1 % орнитина, в третью — 1 % аргинина. Аминокислоты должны быть в L-форме, если имеются D-аминокислоты, то добавляют 2 %, т. к. микроорганизмы активны только в отношении L-форм. После добавления аминокислот перед стерилизацией в случае необходимости реакцию среды исправляют 0,1 %-м раствором соляной кислоты. Среду разливают по 1—2 мл в химически чистые стерильные пробирки и стерилизуют при давлении 0,1—0,2 атм 20 мин. Небольшое количество флокулята в средах не имеет значения. Пептонно-дрожжевая среда имеет травянисто-зеленый цвет, при кислой реакции среда желтеет, при щелочной – синеет.
Мясо-пептонный бульон: мясная вода с 1 % сухого пептона и 0,85 % поваренной соли. Смесь кипятят до полного растворения пептона и соли, устанавливают нужную реакцию среды, стерилизуют при 0,7 атм 20 мин.
7.2. Реактивы
|
|
|
