Методы обнаружения мутаций

Методы обнаружения мутаций предполагают обязательное секвенирование содержащих их сегментов ДНК с целью точной идентификации нуклеотидных нарушений, оценки их фенотипического проявления и определения причастности к развитию болезни. Поэтому они редко используются в практической диагностике и при популяционном скрининге гетерозигот. После описания мутации появляется возможность ее анализа более простыми способами, не требующими секвенирования.

Мутации, изменяющие длину амплифицированных фрагментов, могут быть выявлены с помощью нативного электрофореза в полиакриламидном или агарозном гелях.

Из миссенс-мутаций наиболее просто диагностируются те замены нуклеотидов, которые приводят к исчезновению или образованию сайта узнавания для какой-нибудь из рестриктаз. Они выявляются по изменению длины амплифицированного фрагмента ДНК после его обработки соответствующей эндонуклеазой. Поэтому сразу после идентификации мутации проводится компьютерный поиск возможных сайтов рестрикции в месте локализации замены основания. Вероятность такого события довольно велика, так как для каждой из нескольких сотен известных в настоящее время рестрикционных эндонуклеаз сайтом узнавания служит своя специфическая последовательность ДНК, средние размеры которой составляют 5-6 нуклеотидов.

Методы выявления мутаций довольно разнообразны и постоянно совершенствуются. В первую очередь, молекулярному анализу подвергают те гены, повреждения которых сопровождаются развитием наиболее частых заболеваний. Исследования проводят либо в семьях высокого риска, где уже имеются больные с тем или иным моногенным заболеванием с целью выявления гетерозиготных носителей, либо непосредственно в популяциях, где имеется большая выборка больных и можно предполагать высокую частоту гетерозиготных носителей мутаций. При этом выбор конкретных схем идентификации мутантных аллелей зачастую определяется диагностическими возможностями лабораторий и стоимостью анализов. Особое внимание уделяют поиску тех аллелей, которые встречаются в популяциях с высокой частотой. Именно для таких мутаций разрабатывают более простые и эффективные методы молекулярной диагностики, позволяющие тестировать больных и проводить скрининг гетерозигот среди их родственников или среди определенных групп населения.

Важнейшей характеристикой мутантного аллеля является его корреляция с тяжестью течения заболевания, т. е. фенотипическое выражение мутации в гомозиготном и в гетерозиготном состояниях, а также в компаунде с другими мутантными аллелями того же гена. Для многих моногенных болезней обнаружено большое число аллелей, которые по своему клиническому проявлению могут быть подразделены на различные группы: от очень мягких, оказывающих незначительный повреждающий эффект, до летальных или полулетальных, обусловливающих смерть пациентов в раннем возрасте. Таким образом, молекулярная диагностика мутаций может иметь определяющее значение для прогнозирования развития заболевания и выбора адекватной тактики лечения. Подобные скринирующие программы в настоящее время разработаны и успешно осуществляются во многих странах для таких распространенных заболеваний, как серповидно-клеточная анемия, муковисцидоз.

Метод ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза. Если естественных рестрикционных сайтов в месте мутации найти не удается, то такие сайты могут быть созданы искусственно. В частности, разработана методика создания с помощью ПЦР новых сайтов рестрикции в мутантных аллелях, но не в аллелях дикого типа - метод ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза. Для этого амплифицируемый участок ДНК выбирают таким образом, чтобы 3'- конец одного из праймеров непосредственно примыкал к мутантному сайту. Именно этот праймер неполностью комплементарен матричной ДНК. В нем изменяют один из нуклеотидов с 3'-конца так, чтобы в сочетании с нуклеотидом мутантного, но не нормального сайта в этом месте образовывался сайт рестрикции для какой-нибудь из эндонуклеаз. Тогда после рестрикции и электрофореза продуктов амплификации геномной ДНК у индивидуумов, не содержащих данную мутацию, на электрофореграмме будет присутствовать один нерестрицированный фрагмент, у гетерозигот появится два дополнительных фрагмента, соответствующих по длине рестрицированным сегментам ДНК, и у гомозигот по мутации будут присутствовать только эти два фрагмента.

ARMS (amplification refractory mutation system). Концептуально близким к методу ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза является метод, получивший название "амплификация рефракторной мутационной системы" - amplification refractory mutation system - ARMS. В основе метода лежит неспособность Taqi термофильной полимеразы к амплификации фрагмента при наличии несоответствия (mismatch) между матричной ДНК и 3'-концом одного из олигопраймеров. Суть метода заключается в одновременном проведении двух ПЦР, для каждой из которых одним из праймеров служит аллель- специфическая мутантная или нормальная олигонуклеотидная последовательность соответственно. При этом в качестве второго праймера для проведения двух реакций выбирают одну и ту же олигонуклеотидную последовательность, так что в обоих случаях могут амплифицироваться участки ДНК одинаковой протяженности. Мутантный сайт в аллель-специфических праймерах расположен не в центре, а ближе к 3'-концу, и чаще всего занимает предпоследнюю позицию. При определенных условиях, важнейшим из которых является концентрация ионов магния в растворе, наличие сайта негомологичного спаривания в 3'-области праймера препятствует началу синтеза ДНК. Таким образом, при наличии мутации в исследуемой матричной ДНК амплифицированные фрагменты образуются только в том случае, если в качестве аллель-специфического праймера выбирается мутантная последовательность, тогда как при использовании нормального олигонуклеотидного праймера ПЦР блокируется.

Метод нашел широкое применение для детекции мутаций при фенилкетонурии, бета-талассемии, муковисцидозе, при типировании генов HLA-системы. Однако сложности в подборе праймеров и в выборе оптимального режима ПЦР ограничивают широкое применение этого метода. Вместе с тем его несомненным преимуществом является возможность применения полностью автоматического сканирования.

OLA (oligonucleotide ligation assay) - методы детекции состояния гена, основанные на дотировании синтетических олигонуклеотидных зондов.

При проведении этих реакций специфические ДНК- или РНК- последовательности исследуют путем использования их в качестве матрицы для ковалентного связывания двух пар олигонуклеотидных зондов. ДНК-зонды для лигирования подбирают таким образом, чтобы они были полностью комплементарны нормальному фрагменту ДНК в области локализации мутации, причем сама нуклеотидная замена должна находиться на стыке двух праймеров. Обычно в один из зондов вводят радиоактивную или флюоресцентную метку, а другой метят биотином.

После гибридизации при строго стандартных условиях синтезированные олигонуклеотидные последовательности сшивают ДНК- лигазами из термофильных микроорганизмов. Такие ферменты работают при высоких температурах и сохраняют свою активность в условиях, необходимых для проведения денатурации молекул ДНК. При наличии мутации в тестируемой молекуле ДНК на конце одного из зондов образуется сайт некомплементарного спаривания, непосредственно примыкающий к месту лигирования. Наличие терминального неспаренного основания в смежно расположенных последовательностях ДНК-зондов резко снижает скорость лигирования, и при определенных условиях проведения реакции сшивки между зондами в этом случае не происходит.

Метод включает несколько последовательных циклов гибридизации, лигирования и денатурации. Начиная со второго цикла, матричной ДНК для гибридизации зондов наряду с тестируемой пробой служат также дотированные последовательности. В дальнейшем проводят электрофоретический анализ меченых однонитевых фрагментов ДНК. Система успешно апробирована на мутациях глобиновых генов при серповидно-клеточной анемии и на мутации delF508 при муковисцидозе.

ASO метод обнаружения мутаций. Универсальным методом детекции замен оснований является метод аллель-специфических олигонуклеотидов - ASO, который включает амплификацию фрагментов ДНК и последующую дот- или слот- гибридизацию с мечеными аллель-специфическими олигонуклеотидами. Для этого синтезируют два типа олигонуклеотидных последовательностей обычно размером 19 п.о., в которых мутантный сайт занимает центральное положение. Каждый из этих олигонуклеотидных зондов комплементарен нормальному или мутантному вариантам ДНК, соответственно. Условия гибридизации подбирают таким образом, чтобы дуплексы образовывались только при полной комплементарности гибридных пар. В этих условиях амплифицированные фрагменты ДНК без мутации будут гибридизоваться только с нормальным зондом, ДНК гомозигот по мутации - только с мутантным и ДНК гетерозигот - с обоими олигонуклеотидами. Для уменьшения перекрестной аллель-специфической гибридизации в реакционную смесь добавляют 30-кратный избыток конкурентного немеченого олигонуклеотидного ДНК-зонда.

Разработаны удобные модификации метода ASO с использованием аллель-специфических ДНК-зондов, меченных биотином или пероксидазой хрена.

Наиболее быстрым, экономичным и удобным методом сканирования точечных мутаций является модифицированный вариант ASO, так называемая гибридизационная система обратного дот-блота (reverse dot-blot hybridisation system). Метод позволяет одновременно скринировать сразу много точечных мутаций и доступен автоматизации. В этом случае проводят гибридизацию меченых продуктов ПЦР, обычно представляющих собой отдельные экзоны, с фиксированными на нейлоновых фильтрах аллель-специфическими олигонуклеотидными зондами (ASO).

Предварительную иммобилизацию мутантных и нормальных ASO- зондов на мембранах осуществляют за счет присоединения гомополимерных Т-хвостов с дезоксирибонуклеотидтрансферазой на конце. При этом олигонуклеотидные последовательности остаются свободными и могут участвовать в гибридизации с мечеными амплифицированными фрагментами ДНК. После отмывки несвязавшихся молекул ДНК радиоавтографические или цветные пятна на фильтрах становятся заметными только в местах локализации олигонуклеотидов, полностью комплементарных тестируемой геномной ДНК. Реакцию обычно проводят в присутствии ионов тетраалкиламмония, уменьшающих зависимость температуры плавления от композиции оснований. Это позволяет использовать одинаковые условия гибридизации для различных олигонуклеотидов, т. е. вести поиск сразу нескольких типов мутаций, локализованных в одном и том же экзоне гена.

Данный метод положен в основу разработки специальных систем, предназначенных для одновременной детекции наиболее распространенных мутаций в исследуемом гене. Система представляет собой ленточный фильтр (стрип) с нанесенными пятнами олигопраймеров, каждый из которых соответствует определенной мутации. Стрип помещают в раствор со смесью тех меченых амплифицированных экзонов, которые могут содержать тестируемые мутантные аллели и создают условия для аллель-специфической гибридизации. Таким способом сканируют одновременно 42 мутации, ответственные за серповидно-клеточную анемию, 34 мутации - при муковисцидозе.

Метод разделения продуктов ПЦР в MDE-гелях. Очень простой метод обнаружения и идентификации мутаций в амплифицированных фрагментах ДНК основан на анализе характера электрофоретического разделения продуктов ПЦР в MDE- гидросвязывающих гелях в присутствии высоких концентраций мочевины. Эти гели способствуют формированию гетеродуплексов в процессе электрофореза, причем расположение дуплексов очень специфично для различных мутантных аллелей, локализованных в одном и том же амплифицированном фрагменте. Это позволяет не только выявлять, но с высокой степенью вероятности идентифицировать известные мутации. В мультиплексном варианте методики возможен одновременный поиск мутаций в нескольких амплифицированных фрагментах.

Простота и высокая скорость анализа способствуют разработке на основе разделения в MDE-гелях схем максимальной автоматизации процесса поиска и идентификации известных мутаций у пациентов и гетерозиготных носителей мутаций.