 |
1.3 ПЦР в реальном времени (Real-Time-PCR, qPCR, qRT-PCR)
|
|
|
|
1. 3 ПЦР в реальном времени (Real-Time-PCR, qPCR, qRT-PCR)
Поскольку в ходе ПЦР происходит наработка определенного участка ДНК, по окончании реакции можно зарегистрировать полученный фрагмент при помощи ряда методов, наиболее популярным из которых является метод электрофореза в геле с окрашиванием ДНК бромистым этидием. Однако регистрация результата реакции по ее завершении не дает информации об эффективности процесса. Поэтому применение классической ПЦР ограничено задачами, в которых достаточно получения ответа по принципу " да - нет".
В начале 1990-х гг. было предложено регистрировать накопление ДНК непосредственно в ходе ПЦР с целью количественного определения исходного числа ДНК-матриц, попавших в реакционную смесь. Для регистрации процесса амплификации в режиме реального времени в реакционную смесь добавляют флуоресцирующие и/или интеркалирующие красители, такие как SYBRGreen, SYBRBlue или ROX, по интенсивности флуоресценции которых можно судить об эффективности процесса амплификации (Рис. 8). Использование оптической детекции также исключает необходимость стадии электрофореза. Кроме того, флуоресцентные методы позволяют избирательно регистрировать амплификацию лишь определенных фрагментов ДНК, что повышает достоверность исследования.
Рис. 8. Детекция кинетики ПЦР в реальном времени с помощью флуоресцентных зондов.
Экспоненциальная стадия ПЦР описывается уравнением:
(1)
где Pn - количество молекул продукта/репортерной флуоресценции к циклу n, P0 - исходное количество молекул, содержащих амплифицируемый фрагмент (template), E - эффективность амплификации. В идеальных условиях E = 2, т. к. на каждом цикле ПЦР происходит удвоение количества продукта.
|
|
|
Прологарифмировав обе части уравнения (1) получим:
(2)
Назовем пороговым циклом (threshold cycle, Ct)) такой цикл n, на котором достигается некий заданный уровень репортерной флуоресценции - пороговая флуоресценция PCt = const. Для n=Ct уравнение 2 принимает вид:
(3)
Т. е. значение Сt прямо пропорционально логарифму количества субстрата. Таким образом, ПЦР в реальном времени позволяет сравнивать количества субстрата при условии, что эффективность реакции и заданный уровень пороговой флуоресценции одинаковы для каждой из сравниваемых реакций.
Однако величина Сt может зависеть от многих случайных факторов, например чувствительности детектора, качество фильтра. Поэтому точно начальное количество интересующего продукта померить нельзя. Для решения этой проблемы существуют методы нормировки. Измеряют отношение количеств двух молекул в пробе. Нормализацию обычно проводят по продуктам амплификации так называемых генов домашнего хозяйства (housekeeping genes) уровень экспрессии которых в клетке всегда примерно одинаков.
Вместе с тем, классическая ПЦР сохраняет свою актуальность в методиках, требующих наработки фрагментов ДНК с целью их дальнейшего использования (клонирования или секвенирования). В этих случаях, присутствие интеркалирующих красителей может помешать последующим процедурам.
1. 3. 1 Детекция амплификации ДНК в режиме реального времени
Все существующие режимы регистрации накопления продуктов ПЦР в режиме реального времени основаны на измерении флуоресценции реакционной смеси таким образом, чтобы интенсивность флуоресценции была пропорциональна количеству наработанной в ходе реакции ДНК.
Способные к флуоресценции молекулы (флуорофоры) поглощают свет одной длины волны и испускают свет в более длинноволновой части спектра, что следует из основного постулата квантовой механики:
|
|
|
,
где E - энергия фотона, h - постоянная Планка, λ - длина электромагнитной волны, υ - частота электромагнитных колебаний, c - скорость света в вакууме.
Длины волн поглощения и испускания, а также количество поглощенного и испущенного света являются характеристикой каждого флуорофора и могут существенно различаться для разных соединений, что делает возможным независимо детектировать в системе сигналы сразу от нескольких флуорофоров.
Поглощение света флуорофором переводит электроны отдельных атомов этого химического соединения на более высокие энергетические уровни (возбужденное состояние). Электроны остаются в возбужденном состоянии около 10-8 с, после чего флуорофор снова переходит в стационарное состояние, испуская при этом фотон. Поскольку часть энергии возбужденного электрона рассеивается в виде тепла, длина волны испускаемого фотона всегда больше длины волны поглощенного фотона (правило Стокса).
Таким образом, процесс флуоресценции состоит из многократно повторяющихся циклов поглощения-испускания фотонов и, в конце концов, приводит к разрушению флуорофора (фотообесцвечивание).
В настоящее время для визуализации результатов ПЦР в реальном времени используется весьма широкий спектр флуорофоров, таких как SYBR Green, SYBR Gold, SYBR Blue, Alexa Fluor 488/532/633, ROX, Cy3, Cy5 и т. д. С характеристиками отдельных флуорофоров можно ознакомиться в соответствующей справочной литературе. В большинстве методик применяемых для детекции ПЦР в реальном времени используются подходы, основанные на одновременном мечении праймеров или зондов флуорофором и веществом, способным подавлять флуоресценцию (гасителем).
Существует несколько систем детекции амплификации ДНК в режиме реального времени, которые принято подразделять на специфические и неспецифические к определенной последовательности ДНК. Неспецифические системы детекции проявляют любую образовавшуюся в ходе реакции ДНК (включая и димеры праймеров), в то время как специфические системы детекции позволяют достоверно регистрировать накопление фрагмента ДНК строго определённой последовательности. В свою очередь, неспецифические системы детекции можно разделить на системы с использованием интеркалирующих красителей и системы с мечением праймеров флуоресцентными красителями.
|
|
|
