 |
Рис. 6 Анализ трех STR-локусов методом ПЦР
|
|
|
|
Рис. 6 Анализ трех STR-локусов методом ПЦР
В рассмотренном случае, индивиды А и В могут быть исключены из числа подозреваемых, а Б остается явным подозреваемым в совершении преступления. Аналогичный подход используется при определении отцовства.
1. 2 Оборудование и материалы для ПЦР
1. 2. 1 Типы ПЦР-амплификаторов
Приборы для проведения ПЦР (термоциклеры, ДНК-амплификаторы, ПЦР-амплификаторы) представляют собой устройства для быстрого изменения температуры реакционной смеси по определенной программе. Все современные амплификаторы можно разделить на модели с возможностью детекции накопления ДНК в процессе реакции (детектируюшие или real-time-амплификаторы) и без таковой (обычные амплификаторы). Детектирующие амплификаторы, в сравнении с обычными амплификаторами, оснащены дополнительной оптической насадкой, позволяющей регистрировать флуоресценцию в закрытой реакционной пробирке (через прозрачную крышку или стенки пробирки) непосредственно во время реакции (Рис. 7).
Рис. 7. Примеры обычного (А) амплификатора С1000 Touch, BioRad (США) и детектирующего амплификатора CFX96 Touch, BioRad (США)
1. 2. 2 Формат пробирок для проведения ПЦР
В настоящее время используют 4 стандартных формата отдельных или стрипованных пробирок для ПЦР: 0, 5 мл (0, 6 мл), 0, 2 мл, 0, 025 мл (384-луночный формат) и 0, 01 мл (1536-луночный формат), а также широкий ассортимент нестандартных емкостей для проведения реакции. Пробирки по 0, 5 мл и 0, 2 мл бывают отдельными, скрепленными по 8 или 12 шт (в " стрипах" ) и в виде 96-луночных планшетов. Форматы 0, 025 мл и 0, 01 мл существуют только в виде 384-луночных или 1536-луночных планшетов. Пробирки на 0, 5 мл и 0, 2 мл выпускают с различной толщиной стенок. На толщину стенок используемых пробирок следует обращать особое внимание, поскольку данный параметр существенно влияет на точность расчета температуры реакционной смеси при использовании регулирования температуры реакционной смеси по математической модели. Некоторые амплификаторы позволяют учесть толщину стенок используемых пробирок в формуле расчета.
|
|
|
1. 2. 3 " Горячий старт" (HotStart)
Несмотря на то, что оптимальная температура для действия большинства используемых для ПЦР ДНК полимераз составляет 60-80°С, большая часть из них сохраняет активность при комнатной температуре. Поскольку компоненты реакции, как правило, смешивают при комнатной температуре, в момент приготовления реакционной смеси праймеры могут неспецифично отжигаться на всегда присутствующую в очищенной ДНК одноцепочечную фракцию или же друг на друга и удлиняться ДНК-полимеразой еще до начала ПЦР. В результате могут появляться неспецифичные фрагменты, эффективно амплифицируемые в ходе последующей реакции. Для предотвращения такого эффекта существует несколько подходов, обозначаемых как " горячий старт".
1. 2. 3. 1 Добавление одного из компонентов реакции при высокой температуре.
Наиболее простым способом является добавление одного из необходимых для реакции компонентов только после достижения реакционной смесью высокой температуры (70 - 95°С). Такими компонентами могут быть: ДНК-полимераза, Mg2+ (образуют растворимые комплексы с dNTP и формируют субстрат для ДНК-полимеразы), dNTP или праймеры. Данный подход удобен при небольшом числе реакций в одном эксперименте. Минусом подхода является повышенная ошибка в количестве отдельно добавляемого компонента.
1. 2. 3. 2 Разделение барьером
Для достижения " горячего старта" можно отделить один из необходимых для ПЦР компонентов барьером, исчезающим при высокой температуре. Чаще всего такой барьер делается из парафина путем разделения смеси на 2 отсека парафиновой пробкой, либо за счет помещения одного из компонентов (Mg2+ или ДНК-полимеразы) внутрь парафиновых шариков. Данный подход применим для масштабных экспериментов. К минусам данной методики можно отнести сложность использования автоматических дозирующих станций для приготовления реакций с парафиновым барьером.
|
|
|
1. 2. 3. 3 Ингибирование полимеразы антителами
При температурах ниже 50-60°С можно блокировать работу полимеразы путем ее связывания с антителами. Для этого используют моно- и поликлональные антитела (обычно мышиные) к ДНК-полимеразе. В зависимости от качества антител используют смеси от 1: 1 до 1: 10 по количеству молей фермента и антител, соответственно. ДНК-полимеразу обычно хранят в заранее изготовленной смеси с антителами, используя эту смесь для приготовления реакций. При нагревании реакционной смеси в ходе первого цикла ПЦР антитела инактивируются и ДНК-полимераза начинает действовать.
1. 2. 3. 4 Использование химически модифицированной полимеразы
Ковалентное присоединение термо- или рН-лабильных химических групп к некоторым аминокислотам ДНК-полимеразы обратимо ингибирует её активность. При 95°С во время первого цикла ПЦР такие химические группы отделяются и фермент начинает работать. Для эффективной активации фермента, как правило, необходима инкубация реакционной смеси перед началом реакции при 95°С в течение 5-20 мин.
1. 2. 3. 5 Использование ингибиторов ДНК-полимеразы
ДНК-полимеразу можно также обратимо ингибировать модифицированными олигонуклеотидами, обладающими высокой константой связывания с ферментом и диссоциирующими из комплекса при сравнительно высоких температурах.
|
|
|
