1.3.1.1 Неспецифические системы детекции

1. 3. 1. 1. 1 Интеркалирующие красители

Использование интеркалирующих красителей (интеркаляторов) представляет собой наиболее дешевый и простой вариант окраски ДНК для проведения ПЦР в реальном времени. Интеркалирующие красители - это соединения, приобретающие способность флуоресцировать при встраивании в двухцепочечную ДНК. В настоящее время существует множество коммерчески доступных интеркаляторов: бромистый этидий, YOYO, SYBR Green. наиболее часто встречающийся в молекулярно-биологической лаборатории интеркалятор - бромистый этидий, применяемый для окрашивания ДНК при электрофорезе. Однако он плохо подходит для регистрации накопления ДНК в ходе реакции, поскольку негативно влияет на эффективность ПЦР. Наиболее распространенным вариантом красителя для ПЦР в реальном времени является SYBR Green I.

Несмотря на удобство в работе, метод использования интеркаляторов обладает существенным недостатком, поскольку интеркалирующие красители " проявляют" накопление любой ДНК, включая димеры праймеров. Поэтому образование флуоресцентного сигнала в ходе реакции не позволяет исследователю быть уверенным, что в результате амплификации наработан целевой фрагмент. Специфичность полученного продукта реакции в данном случае можно попытаться оценить с помощью анализа кривых плавления. Для этого, после окончания ПЦР пробирку медленно нагревают от 40°С до 95°С (или наоборот охлаждают от 95°С до 40°С) и одновременно регистрируют изменение флуоресценции (Рис. 9).

Рис. 9 Кривая плавления продуктов ПЦР (сплошная линия). Прерывистой линией показан график первой производной. Значения максимумов первых производных принимаются за температуру плавления ампликонов.

Фрагменты ДНК различной длины и состава будут плавиться (гибридизоваться) при разной температуре, что позволяет приблизительно оценить состав реакционной смеси после ПЦР. Данный подход имеет низкую разрешающую способность и обычно используется для различения димеров праймеров и длинных продуктов ПЦР.

1. 3. 1. 1. 2 Меченные праймеры с адаптерной последовательностью (амплифлюры)

Существует несколько вариантов использования адаптерных 5ʹ -концевых последовательностей для регистрации накопления продукта ПЦР с участием флуоресцентно меченного праймера. В наиболее простом варианте, праймер несёт дополнительную последовательность на 5ʹ -конце, способную образовывать шпилечную структуру (Рис. 10).

Рис. 10 Схема работы праймеров " амплифлюр"

а - праймер содержит 5ʹ -адаптер с инвертированным повтором, по краям которого расположены флуорофор и гаситель флуоресценции. При температуре элонгации, инвертированный повтор образует шпилечную структуру в которой флуорофор и гаситель оказываются сближены. В ходе синтеза второй цеп ДНК, шпилечная структура " разворачивается" и интенсивность флуоресценции возрастает. б - праймер содержит меченный 5ʹ -адаптер, комплементарный дополнительному олигонуклеотиду с гасителем. Синтез второй цепи " сталкивает" олигонуклеотид с гасителем.

Праймеры несут флуоресцентную метку (флуорофор) и гаситель флуоресценции, расположенные так, что при образовании шпилечной структуры флуорофор и гаситель оказываются пространственно сближенными. В растворе праймеры сохраняют структуру шпильки, имеющую низкий уровень флуоресценции. В ходе реакции, шпилька меченного праймера раскрывается (поскольку меченный праймер становится частью двухцепочечного продукта), что приводит к усилению флуоресценции. Существует также вариант этого метода, при котором гаситель флуоресценции находится на отдельном нуклеотиде, комплементарном 5ʹ -концевой адаптерной последовательности. В этом случае, при встраивании праймера в ДНК гибридизация с гасящим олигонуклеотидом оказывается невозможной.