Рис. 3 Получение геномных (А) и кДНК копий с помощью ПЦР

Рис. 3 Получение геномных (А) и кДНК копий с помощью ПЦР

Существует несколько особенно важных областей применения ПЦР. На сегодняшний день, это основной метод клонирования относительно коротких фрагментов ДНК (менее 10 000 п. н. ). Изначальной матрицей для реакции может служить как ДНК, так и РНК, что позволяет с помощью ПЦР получать как полногеномные копии, так и копии кДНК (Рис. 3). Удобство метода состоит в том, что ген можно клонировать непосредственно с любого фрагмента ДНК или РНК без необходимости первоначального создания библиотек.

Другое применение ПЦР, связанное с ее особой чувствительностью, это поиск патогенов инфекционных заболеваний на ранних стадиях. В этом случае, в качестве праймеров используют короткие фрагменты ДНК, комплементарные какой-либо из уникальных последовательностей генома возбудителя. С помощью большого числа циклов ПЦР можно проверить наличие или отсутствие даже единичных его копий в образце крови (Рис. 4).

Рис. 4 Использование метода ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний.

ПЦР - самый чувствительный метод диагностики для многих инфекций. В настоящее время он часто заменяет иммунологические методы диагностики, такие как ИФА.

ПЦР широко применяется в судебной медицине и криминалистике. Крайне высокая чувствительность этого метода позволяет работать с очень маленькими образцами, такими как волосяная луковица от волоса, мельчайшие следы крови или тканей, которые могут содержать фрагменты лишь одной клетки. Используя ДНК, выделенную из таких образцов, можно получать генетические " отпечатки пальцев" человека, от которого получен образец. Геном каждого человека, за исключением монозиготных близнецов, отличается по последовательности ДНК от генома любого другого человека. ДНК, амплифицированная с помощью ПЦР с использованием определенных праймеров будет различаться по последовательности у разных людей. Используя набор праймеров, покрывающих известные высоковариабильные участки генома человека, можно с помощью ПЦР получить различающиеся генетические " отпечатки пальцев" для каждого человека. Обычно, в таком анализе используют так называемые короткие тандемные повторы (short tandem repeats, STRs), состоящие из таких последовательностей как САСАСА... или GTGTGT..., и находящиеся в различных локусах в геноме человека. Число повторов в каждом STR высоковариабильно в популяции, с разбросом от 4 до 40 у разных индивидов. Из-за разнообразия в этих последовательностях люди обычно наследуют разные варианты каждого STR от матери и от отца; два неродственных человека, как правило, несут разные пары последовательностей. После ПЦР с использованием праймеров, ограничивающих локус, образуется пара полос амплифицированной ДНК от каждого человека, одна из которых представляет материнский вариант STR, а вторая - отцовский. Длина ПЦР-продукта и, соответственно, положение полосы в геле после электрофореза будет зависеть от точного числа повторов в локусе (Рис. 5).

Рис. 5 ПЦР-анализ одного STR-локуса

На Рис. 6 представлен пример анализа трех STR-локусов у трех подозреваемых (А, Б и В), что приводит к образованию шести полос для каждого человека после электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). Несмотря на то, что у разных людей отдельные полосы могут совпадать, общая картина уникальна для каждого человека. Четвертая дорожка геля (Г) содержит продукты ПЦР проведенной с образцом ДНК, полученным из биологического материала, собранного на месте преступления. Чем больше локусов будет проанализировано, тем ниже будет вероятность ошибки из-за совпадения числа повторов в отдельных локусах. Если исследовать вариабельность 5-10 разных STR-локусов, то вероятность того, что у двух случайных людей совпадут " отпечатки пальцев" будет примерно 1 на 10 млн.