 |
3.3 Коструирование векторных систем для трансфекции клеток человека
|
|
|
|
3. 3 Коструирование векторных систем для трансфекции клеток человека
3. 3. 1 Основные векторные системы
Как правило, вводимый генетический материал представляет собой полноразмерную последовательность кДНК определенного гена, инсертированную в экспрессионный вектор и находящуюся под контролем сильного промотора. Выбор подходящего промотора зависит от многих параметров, главным из которых является необходимый уровень экспрессии в клетках-мишенях. Вектор часто содержит один из маркерных генов (neo, β -Gal, ген люциферазы), присутствие которых в трансдуцированных клетках может быть легко обнаружено. Существует 2 типа векторных конструкций:
1) на основе плазмидной ДНК;
2) на основе вирусов;
Плазмидные конструкции удобны для клонирования, генно-инженерных манипуляций, а также получения большого количества рекомбинантной ДНК. Однако, бактериальные плазмиды, в отличие от вирусных конструкций, не способны самостоятельно проникать в эукариотические клетки. Для введения инсертированной в плазмиду экзогенной ДНК в клетки человека необходимо перенести ее в подходящий вирусный вектор или применить способ, облегчающий ее прохождение через клеточные мембраны.
3. 3. 2 Физико-химические методы переноса чужеродной ДНК в клетки эукариот
Чужеродная ДНК может спонтанно проникать в клетки эукариот благодаря наличию в плазматической мембране белков, специфически связывающих ДНК. Путем эндоцитоза чужеродная ДНК попадает в цитоплазму в составе эндосом и обычно быстро разрушается лизосомальными ферментами. Только небольшая часть экзогенной ДНК выходит из экзосом, попадает в ядро и если не разрушается эндогенными нуклеазами, то может быть интегрирована в ДНК клетки. Такое, однако, случается достаточно редко. Исключение составляют скелетные мышцы, в которых благодаря низкой активности эндогенных нуклеаз и низкой пролиферативной активности введенная ДНК может долго (до 1 года) сохраняться и даже экспрессироваться.
|
|
|
Эффективная доставка чужеродной ДНК непосредственно в ядро клетки-мишени может быть осуществлена путем микроиньекции, при помощи электропорации, а также посредством перфорации клеточных мембран золотыми или вольфрамовыми микрочастицами, коньюгированными с чужеродными ДНК и разогнанными до высокой скорости (метод бомбардировки). Эти методы доставки применимы главным образом для клеток, культивируемых in vitro. Исключение составляет лишь метод бомбардировки с использованием специального " генного ружья", который успешно применяется in vivo.
Для повышения эффективности переноса обычно используют соединения или группы соединений, взаимодействующие с ДНК с образованием компактных структур, облегчающих проникновение ДНК в клетки и защищающих ее от действия нуклеаз. Примерами таких способов трансфекции являются система кальций-фосфорной коприципитации, а также рецептор-опосредованный транспорт, предусматривающий создание трехкомпонентной конструкции: ДНК-поликатион + лиганд + вирус.
В качестве лигандов используются специфические белки, такие как трансферрин, эритропоэтин, асиалогликопротеин, коньюгированный с альбумином инсулин и некоторые другие, взаимодействующие с клеточными рецепторами и обеспечивающие фиксацию генной конструкции на специфических клетках (Рис. 36).
Рис. 36 Рецептор-опосредованный перенос гена
Лиганды ковалентно присоединяются к связывающим и компактизующим чужеродную ДНК катионным носителям (полилизин, ДЭАЭ-декстран). Важным компонентом системы является аденовирус, выступающий в качестве эффективного фузогенного агента, обеспечивающего выход экзогенной ДНК из эндосом после попадания ее в цитоплазму клеток-мишеней. Адресная доставка и защита от действия лизосомальных ферментов обеспечивают высокую трансфекционную способность таких конструкций.
|
|
|
Еще одной системой, основанной на сочетании физико-химического подхода и использования вирусов, является конструкция, основанная на использовании филаментного фага fd для трансфекции эпителиальных клеток. Гены fd, кодирующие белки оболочки фага, экспрессируются на его поверхности. В один из них инсертируют последовательность, кодирующую поли-L-лизин. Полилизиновые мотивы в составе химерного белка связываются с плазмидной ДНК и удерживают ее на поверхности фага. В другой ген оболочки фага инсертируют последовательность ДНК, кодирующую какой-либо агент, специфически связывающийся с апикальной поверхностью эпителиальных клеток и интернализирующий конструкцию внутрь клетки. Для этой цели могут использоваться гены патогенных бактерий, поражающих кишечный эпителий, кодирующих белки интерналин и инвазин, а также последовательности ДНК, кодирующие пептидные фрагменты вариабельных доменов моноклональных антител.
Направленный перенос генов во многие типы клеток, содержащие трансферриновые рецепторы, может быть осуществлен при комплексировании ДНК с трансферрином. Использование в этом комплексе аденовирусного вектора существенно облегчает прохождение ДНК через эндосомы и попадание ее в ядро.
|
|
|
