 |
3.3.3 Липосомный метод трансфекции
|
|
|
|
3. 3. 3 Липосомный метод трансфекции
Эффективный внутриклеточный транспорт и защита от деградации лизосомальными ферментами достигаются при использовании в качестве векторов липидных везикул (липосом), обладающих выраженными фузогенными свойствами. Особенно перспективны в этом отношении липосомы, полученные на основе катионных липидов, обеспечивающих 100% связывание ДНК в конденсированные нуклеолипидные частицы. Положительный заряд на поверхности таких везикул обеспечивает их эффективное слияние с отрицательно заряженными клеточными мембранами и прямое попадание чужеродной ДНК в цитоплазму, минуя эндосомы. Особенно эффективными являются комплексы, в которых липосомы коньюгируют с мембранными антителами к определенным белкам-мишеням (иммунолипосомы) или с белками-лигандами. Эти конструкции обеспечивают эффективную адресную доставку чужеродной ДНК в клетки-мишени.
3. 3. 4 Рекомбинантные вирусы
Эволюционно сложившаяся система эффективного проникновения вирусов в клетки-мишени, а в случае ретровирусов и система интеграции в клеточный геном позволяет использовать вирусы, как естественные векторы чужеродной ДНК для клеток млекопитающих.
В качестве векторов чаще всего применяют следующие рекомбинантные вирусы:
1) ретровирусы
2) аденовирусы
3) аденоассоциированные вирусы
4) вирус гепреса (HSV)
5) вирус ВИЧ (HIV)
6) вирус ветряной оспы
Ретровирусные векторы представляют собой генные конструкции на основе ретровирусов (РНК-содержащих вирусов), особенно часто используемые для трансдукции ДНК ex vivo. Наиболее популярным ретровирусным вектором является вирус мышиного лейкоза Molony (MoMLV). По сравнению с другими типами векторов ретровирусы обладают уникальной способностью эффективно переносить чужеродные гены и стабильно интегрировать их в геном делящихся соматических клеток. Для безопасности ретровирусные последовательности модифицируют таким образом, что в инфицированных ими клетках не производятся вирусные белки. Это достигается за счет удаления или инактивации всех кодирующих последовательностей вируса. Репликация вирусных векторов может происходить только в специальных " пакующих" клетках, в геном которых встроены все гены, кодирующие вирусные белки. При введении ретровирусных векторов в эти клетки образуются вирионы, несущие векторные РНК и способные лишь проникать в клетки-мишени, но не размножаться в них. Недостатком данной системы, также как и других векторных систем на основе вирусов, является возможность контаминации производящей клеточной линии нормальным ретровирусом и получения на его основе компетентного по репликации вируса. Для предотвращения этого необходимо регулярное тестирование " пакующей" линии клеток. К другим серьезным недостаткам ретровирусных векторов относятся:
|
|
|
1) их способность трансдуцировать только пролиферирующие клетки;
2) способность индуцировать мутации при случайной интеграции в геном;
3) возможность спонтанной активации онкогена;
4) небольшие размеры переносимой ДНК-вставки - до 8000 п. о.
5) сравнительно низкий титр (106 - 107 на 1 мл) рекомбинантных вирусных частиц, получаемых для трансдукции;
6) необходимость конструирования соответствующих " пакующих" клонов клеток;
Аденовирусные векторы в отличие от ретровирусов активно инфицируют неделящиеся клетки, обладают большей потенциальной пакующей способностью (> 8000 п. о. ), имеют более высокий титр (1011 на 1 мл), однако не обеспечивают встраивание чужеродной ДНК в геном клетки-хозяина. Их использование перспективно для генокоррекции клеток верхних дыхательных путей, легких, мозга, печени, мышц, кожи и др. Данный тип векторов был использован в первых клинических испытаниях по генотерапии муковисцидоза, показавших их эффективность при доставке аэрозольным способом. В аденовирусные векторы также инсерцируют маркерные гены (neo, CAT, β -галактозидазный ген (β -Gal)) для последующей идентификации трансдуцированных клеток. Для конструирования векторов используют дефектные по репликации аденовирусы, которые получают путем вырезания из вирусной ДНК генов, кодирующих белки E1a, E1b, а также регуляторный белок E4. Такая конструкция может поддерживаться только в присутствии клеток-помошников (например, в культуре клеток почек человека). Удаление большого числа аденовирусных генов из векторов часто сопровождается их дестабилизацией, что является одним из главных их недостатков, так как в ряде случаев остающиеся гены, трансдуцированные в клетки-мишени способствуют формированию иммунного ответа.
|
|
|
Аденоассоциированные вирусы (AAV) обладают значительно меньшей пакующей способностью (~5000 п. о. ). Однако, в отличие от ранее рассмотренных вирусов, они не обладают онкогенной активностью, не патогенны, способны интегрироваться в геном, где преобладают в латентном состоянии. Уникальной особенностью AAV является их способность к стабильной неслучайной интеграции в один из районов хромосомы 19. Специфичность интеграции вируса определяется наличием в его геноме гена rep. близкородственные к AAV парвовирусы (H1, MVM, LuIII) обладают еще меньшей пакующей способностью (~2000 п. о. ) и не обладают способностью к специфическому встраиванию. Однако, они также рассматриваются как потенциальные векторы.
Вирус простого герпеса (HSV) - это крупный (152 тыс. п. о. ) ДНК-содержащий вирус, не интегрирующийся в геном при трансформации и формирующий эписомные структуры в ядрах клеток. Уникальной особенностью HSV является его выраженная тропность к клеткам нервной ткани, в связи с чем представляется перспективным его использование для терапии опухолей ЦНС, а также болезни Паркинсона и других нейродегенеративных заболеваний. Преимуществом HSV как вектора для генной терапии состоит в его высокой пакующей способности (> 30 000 п. о. ). Важным этапом в создании векторов на основе HSV является удаление из его генома области ICP22, ответственной за синтез литических белков, и индукция мутации 1814, вызывающей блок транскрипции вирусной ДНК. В последнее время на основе HSV стали получать искусственные производные вируса, так называемые " ампликон-продукты", лишенные практически всех генов HSV, но способные к репликации.
|
|
|
Конструкции векторов, используемых для переноса экзогенных ДНК в клетки человека, постоянно совершенствуются в зависимости от типа клеток-мишеней. Так, новый тип векторов, сконструированных на основе псевдоаденовирусов, сочетает в себе все преимущества аденовирусных векторов, но при этом собственные вирусные гены практически не оказывают никакого повреждающего эффекта на трансформированные клетки-мишени, так как содержат очень мало регуляторных элементов и последовательностей, ответственных за упаковку и репликацию аденовируса. Кроме того, псевдоаденовирусные векторы с успехом переносят чужеродные последовательности ДНК как в делящиеся, так и в покоящиеся клетки. Изучаются также перспективы использования для генной терапии других вирусных систем, таких как SV40, HIV (ВИЧ), вирус ветряной оспы и др. В частности, представляются перспективными эписомные (неинтегрирующиеся в геном реципиента) векторы, полученные на основе очень крупного вируса Эпштейна-Барра, который способен нести вставку размером от 60 до 330 тыс. п. о.
В последнее время, особое внимание уделяется созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих (Mammalian Artificial Chromosomes, MAC), которые могли бы достаточно автономно находиться в ядре, сохраняя способность к репликации и экспрессии. Удобными моделями для этого представляются циркулярные микрохромосомы раковых клеток.
Особенно привлекательной в отношении генной коррекции представляется возможность замены всего мутантного гена или его мутировавшей части (например, одного экзона) на его нормальный аналог, что может быть достигнуто с помощью гомологической рекомбинации. Такой подход может обеспечить не только продолжительную персистенцию введенного гена, но и сохранение удовлетворительного уровня его экспрессии. С этой целью, в конструкции, используемые для переноса ДНК, включают агенты, повышающие частоту гомологичного спаривания, например, ген бактериальной рекомбиназы. В таких условиях частота гомологичной рекомбинации может быть достаточной для того, чтобы с помощью ПЦР отобрать нужные клоны клеток.
|
|
|
