 |
Тема: "Использование ДНК-технологий в медицине: методы ПЦР и секвенирования. генная терапия"
|
|
|
|
Тема: " Использование ДНК-технологий в медицине: методы ПЦР и секвенирования. генная терапия"
|
Часть I |
Часть II | ||||||||||
| № | ответ | № | ответ | № | ответ | № | ответ | № | ответ | № | ответ |
Ответы к задачам
Ответ к задаче №1: После дополнительного раунда репликации будет 2 фрагмента, показанных серым, 4 - зеленым, 4 -красным и 22 - желтым цветом. После второго дополнительного раунда - 2 фрагмента серым, 5 - зеленым, 5 - красным и 52 - жёлтым. Таким образом, число фрагментов ДНК, показанных жёлтым, растет экспоненциально и в конце концов сильно превысит количество других продуктов реакции. Их длина равна длине последовательности ДНК, расположенной между двумя праймерами, плюс длине 2-х праймеров.
Ответ к задаче №2 Масса молекулы ДНК длиной 500 п. н. равна 5, 5х10-19 г.: (2х500х330 г/моль)/6х1023 (число Авогадро). Если пренебречь сложностями нескольких первых шагов реакции амплификации, во время которых образуются более длинные продукты, в конечном счете вносящие незначительный вклад в общее количество амплифицированной ДНК, то можно считать, что это количество удваивается при каждом шаге амплификации. Поэтому: 100х10-9 г = 2Nх5, 5х10-19, где N - число циклов ПЦР. Решение этого уравнения для N = log (1, 81x1011)/log 2 = 37, 4. Таким образом, требуется всего 40 циклов амплификации, чтобы из одной молекулы ДНК получить ее количество, достаточное для биохимического анализа. Процедура автоматизирована и занимает несколько часов.
Ответ к задаче №3 Если количество ddNTP увеличить по отношению к количеству dNTP, полимеризация ДНК будет прерываться чаще, и начнут образовываться более короткие цепочки ДНК. В таких условиях удобно определять нуклеотидные последовательности, расположенные близко к используемому в реакции ДНК-праймеру. Напротив, при пониженном отношении ddNTP/dNTP образуются более длинные фрагменты ДНК, что позволяет определить нуклеотидные последовательности, более удаленные от праймеров.
|
|
|
Ответ к задаче №4
А)
1)5ʹ TATAAACTGGACAACCAGTTCGAGCTGGTGTTCGTGGTCGGTCGGTTTTCAGAAGATCCTAACGCTGACG3ʹ
2)3ʹ ATATTTGACCTGTTGGTCAAGCTCGACCACAAGCACCAGCCAGCCAAAAGTCTTCTAGGATTGCGACTGC5ʹ
Последовательность ДНК, от 5ʹ -конца к 3ʹ -концу, прочитывается начиная с нижней части геля, куда попадают самые короткие фрагменты ДНК. Каждая полоска образуется в результате включения подходящего ddNTP и 2-х полосок с одинаковой подвижностью быть не должно. Это позволяет определить последовательность ДНК, считывая все полоски по очереди, начиная с нижней части геля и определяя правильный нуклеотид в зависимости от того, на какой из 4-х дорожек находится полоска. Нуклеотидная последовательность верхней цепи (1) получена непосредственно из данных электрофореграммы, а нижняя последовательность (2) построена по принципу комплементарности.
Б) Последовательность нуклеотидов ДНК можно перевести в аминокислотную последовательность, используя генетический код. Однако, имеются 2 цепи ДНК, которые могут транскрибироваться в мРНК, и три рамки считывания для каждой из цепей. Таким образом, существует 6 аминокислотных последовательностей, которые могут быть закодированы в данном отрезке ДНК. Из 3-х рамок считывания, возможных для верхней цепи (1), только одна не прерывается стоп-кодонами (TAA, TGA). Из 3-х рамок считывания для нижней цепи (2) в 2-х также есть стоп-кодоны. Третья рамка дает следующую последовательность:
Ser-Ala-Leu-Gly-Ser-Ser-Glu-Asn-Arg-Pro-Arg-Thr-Pro-Ala-Arg-Thr-Gly-Cys-Pro-Val-Ile
|
|
|
На основе имеющейся информации нельзя точно сказать, какая из 2-х открытых рамок считывания, действительно кодирует белок, закодированный данным участком ДНК.
Ответ к задаче №5 А) Дети 2 и 8 имеют идентичный паттерн STR и поэтому являются монозиготными близнецами. Дети 3 и 6 также имеют идентичный паттерн STR и также являются монозиготными близнецами. Две другие пары близнецов - дизиготные, поскольку их паттерны STR не идентичны. У дизиготных близницов, как и у любых двух потомков одной пары родителей, идентично около половины генома. Поэтому около половины полиморфизмов STR у дизиготных близнецов будут идентичны. Используя это признак, можно установить, что пары дизиготных близнецов - дети (1 и 7) и (4 и 5).
Б) Установить, какие дети каким родителям принадлежат, можно с посощью того же варианта анализа STR-полиморфизма. Каждая полоска на картине STR должна соответствовать полосе одного из родителей. В среднем каждый ребенок будет иметь половину полиморфизмов, характерных для каждого из родителей. Таким образом, уровень сходства между каждым ребенком и каждым родителем будет примерно таким же, как и между дизиготными близнецами.
Ответ к задаче №6
Продукты будут представлять собой большое число различных одноцепочечных фрагментов ДНК, по одной для каждого нуклеотида в последовательности. Однако, каждая молекула ДНК будет одного из 4-х цветов, определяемого тем, какой из 4-х ddNTP останавливает полимеризацию данной цепи. Разделение с помощью электрофореза даст серию полосок, каждая из которых отличается на 1 нуклеотид, и последовательность можно будет определить по порядку расположения цветов. Описанный метод лежит в основе стратегии секвенирования ДНК в большинстве автоматических ДНК-секвенаторов.
|
|
|
