Нормально-фазовая ВЭЖХ с полярными адсорбентами (адсорбционная жидкостная хроматография).

• Сорбенты: силикагель, оксид алюминия.

• Растворители: хлороформ, н -гексан,изооктан, диизопропиловый эфир.

• Полярные микродобавки: вода, ацетонитрил, изопропанол, триэтиленгликоль.

Разделение веществ методом адсорбционной жидкостной хроматографии осуществляется в результате их взаимодействия с адсорбентами, такими как силикагель или оксид алюминия, имеющими на поверхности активные центры. Достигаемое при движении по колонке вместе с подвижной фазой разделение зон компонентов анализируемой пробы зависит от различия в их способности к взаимодействию как с адсорбентом, так и с растворите­лем.

В основе сорбции на поверхности адсорбента, имеющего гидроксильные группы, лежит взаимодействие меж­ду полярной поверхностью адсорбента и полярными группами или участками молекул. К таким взаимодействиям относят диполь-дипольное взаимодей­ствие между постоянными или индуцированными диполями, об­разование водородной связи вплоть до образования комплексов или комплексов с переносом заряда.

Наибольшее применение в ВЭЖХ находят адсорбенты из силикагеля с разным диаметром и объемом пор и поверхностью. Значительно реже используют оксид алюминия и очень редко — другие адсорбенты, широко применяющиеся в класси­ческой колоночной и тонкослойной хроматографии. Основная причина этого — недостаточная механическая прочность большинства адсорбентов, не позволяющая заполнять колонки и использовать их при повышенных давлениях, характерных для ВЭЖХ.

Полярные группы, обусловливающие адсорбцию и находя­щиеся на поверхности силикагеля и оксида алюминия, по свой­ствам близки. Поэтому обычно порядок элюирования смесей ве­ществ и элюотропный ряд растворителей (по силе элюирования) для них одинаковы. Однако различие химического строения силикагеля и оксида алюминия может приводить к появлению различий в селектив­ности — тогда предпочтение отдают тому или другому адсор­бенту, более подходящему для данной конкретной задачи. На­пример, оксид алюминия обеспечивает большую избиратель­ность при разделении полициклических ароматических углеводородов.

Предпочтение, отдаваемое обычно силикагелю по сравнению с оксидом алюминия, объясняется более широким выбором силикагелей по пористости, поверхности и диаметру пор, а также значительно более высокой каталитической активностью оксида алюминия, нередко приводящей к искажению результатов ана­лиза вследствие разложения компонентов пробы либо из-за их необ­ратимой хемосорбции.

Адсорбционная активность силикагеля достаточно легко воспроизводится путем определенных операций гидроксилирования, сушки и активации. Было обнаружено, что при многократном использовании доста­точно трудно поддерживать колонку с силикагелем в таких условиях работы, при которых времена удерживания и получаемое раз­деление оставалось бы стабильными. Это связано с тем, что алканы, ис­пользуемые в ПФ в качестве основных растворителей (н -гексан, н -гептан, изооктан) обычно содержат очень небольшое количество воды (десятки частей на миллион, ppm) в состоянии насыщения или меньше, даже если их осушали тем или иным способом. Силикагель в колонке, не имеющий на поверхности адсорбированной воды, является эффективным осушителем и отнимает воду от растворителя, меняя при этом свою активность как адсорбент. Хроматографические характеристики его при этом, естественно, также изменяются. Это продолжается до тех пор, пока не установится равновесие меж­ду количеством воды, поглощаемой и отдаваемой силикагелем. Если при смене растворителя новая партия его будет иметь иную степень насыщенности водой, чем предыдущий растворитель, снова будет происходить длительный процесс установления нового динамического равновесия, и хроматографические характеристики снова изменятся.

Существуют методы, которые позволяют получить вос­производимые хроматографические характеристики колонки с силикагелем. Один из них заключается в использовании безвод­ного гексана, модифицированного для получения нужной селек­тивности метиленхлоридом или ацетонитрилом. Так как их со­держание в гексане существенно выше, чем воды (при равной элюирующей силе), равновесие устанавливается существенно быстрее, и его легче поддерживать. В другом методе с использованием гексана при его модификации водой применяют так называемую систему контроли­руемой влажности. Метод основан на создании замкну­того цикла растворителя, который после детектора возвраща­ется в систему через большую колонку с обогреваемой термо­статом рубашкой. Большая колонка содержит силикагель или оксид алюминия (увлажненные) и служит для удерживания компонентов разделенных проб и поддержания требуемой влажности гекса­на. Увеличивая или понижая температуру в рубашке, можно изменять количество воды в циркулирующем гексане и, следо­вательно, менять параметры удерживания аналитической колон­ки.

При анализе веществ, достаточно сильно взаимодействую­щих с силикагелем, например, фенолов или спиртов, алифатические углеводороды в ПФ часто модифицируют спиртами, например изопропанолом.

Селективность разделения в нормально-фазовой (адсорбционной) хроматографии определяется химической природой функциональных групп аналита или групп, способных к взаимодействию с центрами адсорбции на поверхности силикагеля, а также степенью пространственно­го затруднения при их сближении до наступления такого взаи­модействия. В ряду функциональных групп ряд возрастания удерживания выглядит следующим образом: фтор — хлор — бром — йод — простой эфир — третичный амин — нит­рил — нитрогруппа — сложный эфир — кетон — альдегид — пер­вичный амин — амид — спирт — фенолкарбоновая кислота — сульфокислота. транс -Изомеры удерживаются слабее, чем цис- изомеры, изомеры с аксиально расположенными группами — слабее, чем с расположенными экваториально. Если групповое разделение (по типу и количеству функциональных групп) ме­тодом адсорбционной хроматографии на силикагеле провести легко, то разделение членов гомологического ряда внутри таких групп, как правило, достигается только для первых членов и быстро ухудшается с ростом числа метиленовых групп.

На рис. 7.3 представлена хроматограмма, демонст­рирующая высокую селективность при разделении сложной смеси метилфенолов и фенола: разделены изомеры, трудно раз­деляемые методом газовой хроматографии и обладающие очень близкими свойствами, такие, как мета- и пара -крезолы и 2,4- и 2,5-ксиленолы.

Рис. 7.3. Хроматограмма смеси фенола, крезолов и ксиленолов, полученная на колонке размером 250×4,6 мм с сорбентом Зорбакс-Сил (6 мкм); подвижная фаза смесь гексана, метиленхлорида и изопропанола (100:10:1 по объему), скорость подвижной фазы 1 мл/мин, УФ-детектор (254 нм), величина пробы 10 мкл: 1 – 2,4,6-триметилфенол; 2 – 2,6-ксиленол; 3 – 2,5-ксиленол; 4 – 2,3-ксиленол; 5 – 2,4-ксиленол; 6 – о -крезол; 7 – 3,5-ксиленол; 8 – 3,4-ксиленол; 9 – м -крезол; 10 – п -крезол; 11 – фенол (цит. по [12]).

Наиболее сильное влияние на удерживание фенолов оказывает, как видно из хроматограммы, экранирование гидроксильной группы даже такой малообъемнойи слабоэкранирующей группой, как метильная. За счет этого различия происходит четкое разделение на 3 группы: орто-, орто- замещенные; орто -замещенные с неэкранированной гидроксильной группой и не имеющие орто -заместителей.

Популярность силикагеля в качестве адсорбента для ВЭЖХ начала падать с появлением и ростом применения полярных сорбентов с привитыми на поверхности функциональными группами, такими, как аминные, нитрильные и диольные. Такие сорбенты более удобны в работе и позволяют легче подбирать селектив­ность, меняя подвижную фазу. Тем не менее, есть качества силикагеля, ко­торые обеспечивают ему достаточно надежное будущее в ВЭЖХ. Это прежде всего относительная дешевизна силикагеля, дающая ему большие преимущества при препаративных раз­делениях, особенно в том случае, когда масштаб их приближа­ется к промышленному. Это хорошая механическая проч­ность, возможность в широких пределах регулировать размер и объем пор, возможность отмыть кислотой от ионов металлов переменной валентности, прокалить при высокой температуре и т. д.

Нормально-фазовая ВЭЖХ с привитыми неподвижными фазами. Недостатки, присущие адсорбционной хроматографии, а также стремление исследователей преодолеть недостатки, характерные для распределительной хроматографии с нанесенными полярными жидкими неподвижными фазами вызвали к жизни сорбенты с привитыми полярными фазами. Такие сорбенты в настоящее время вы­пускаются большинством производителей материалов для хроматографии.

Основными привитыми фазами для нормально-фазовой хроматографии в настоящее время являются нитрильная и аминная. Каждая из них прививается с исполь­зованием соответствующего силана (диметиламинопропилхлорсилана или диметилцианопропилхлорсилана). Нитрильная и аминная привитые неподвижные фазы могут быть использованы не только с неполярными элюентами, но и в обращенно-фазовой ВЭЖХ (с полярными элюентами).

Рис. 7.4. Хроматограмма витаминов в пищевых продуктах, полученная на колонке размером 250×4 мм с Нуклеосилом NH₂ (10 мкм), подвиж­ная фаза: смесь гептан — хлороформ (80: 20 по объ­ему), расход 3.5 мл/мин, УФ-детектор (254 нм), проба 5 мкл: 1 — уксусный эфир витамина А; 2 — витамин Е; 3 — ви­тамин D₃.

Рис. 7.5. Хроматограмма смеси ароматических углеводородов полученная на колонке размером 150 × 4.6 мм с Нуклеосилом NH₂ (5 мкм). Подвижная фаза – изо -октан, 1.4 мл/мин; УФ-детектор (254 нм); объем пробы 20 мкл: 1 – бензол; 2 – нафталин; 3 –фенантрен; 4 – флуорен; 5 – пирен; 6 – 1,3,5-трифенилбензол; 7 – хризен [12].

В качестве нормально-фазовых сорбентов такие сорбенты работают, подобно силикагелю или оксиду алюминия, с теми же элюотропными рядами растворителей и сходными (но не иден­тичными) порядками элюирования соединений разных классов. За счет разной химической природы силанольных, аминных и нитрильных групп нередко возникают различия в селективности разделения, позволяющие отдать предпочтение тому или иному сорбенту.

Растворителями для ПФ могут быть диэтиловый эфир, хлороформ, хлористый метилен. Для вариации элюирующей силы в ПФ добавляют гексан.

Основными преимуществами сорбентов с привитыми нитрильными или аминогруппами по сравнению с адсорбентами яв­ляются следующие: (1) вследствие замещения силанольных групп вероятность необратимой адсорбции веществ уменьшается; (2) снижается влияние следов воды в подвижной фазе на хроматографическое разделение, отпадает необходимость строго конт­ролировать содержание воды в растворителях; (3) быстро дости­гается равновесие с новым составом растворителя, что позво­ляет быстро переходить от одной методики к другой, а также успешно использовать градиентное элюирование; (4) появляется возможность исполь­зовать растворители в широком диапазоне их полярностей, облегчается регенерация ко­лонок; (5) сорбенты с приви­тыми аминогруппами проявляют свойства слабых анионообменников.

Следует принимать во внимание и некоторые особенности применения сорбентов с привитыми аминными неподвижными фазами. Не рекомендуется ис­пользовать в ПФ веще­ства с альдегидными или кетонными группами, так как в этом случае возможно разрушение структуры НФ с об­разованием оснований Шиффа. Наличие таких соединений в составе изучаемых проб может приводить к исчезновению некоторых из их компонентов. Аминные неподвижные фазы легко окисляются. Поэтому следует исключить действие на сорбент сильных окисли­телей. Аналогично, при использовании нитрильной привитой неподвижной фазы следует учитывать возможность реакций с нитрилами выбранного растворителя или компонентов, входящих в состав анализируемых проб.