Обращенно-фазовая ВЭЖХ с привитыми неподвижными фазами.

• Сорбенты: алкилированные силикагели

• Растворители: метанол, ацетонитрил, тетрагидрофуран, вода

Были разра­ботаны и получили известное распространение сорбенты для этого метода на основе силикагеля, имеющие привитые алкилсилильные группы разной дли­ны (от С₂ до С₂₂ с прямой алкильной цепью, фенильной и дифенильной группами). Наиболее широко используются привитые фазы с октадецилсилильной группой (ОДС, или С₁₈).

Химическое модифицирование поверхности силикагеля.

Алкилирование силикагеля представляет собой реакцию, аналогичную реакции инактивации, описанную в главе 6. Например, проводится реакция силикагеля с диметилоктадецилхлорсиланом:

Силанольные группы, находящиеся на поверхности исходного силикагеля, к которым прививается неподвижная фаза, не могут из-за пространственных затрудне­ний быть полностью замещены даже при самых жестких условиях прививки. Сразу уда­ется заместить примерно половину силанольных групп. Остаю­щиеся на поверхности та­кого привитого сорбента силанольные группы могут взаимодействовать с некоторыми компонентами пробы и в ряде случаях быть основным фактором, отвечающим за удерживание веществ, подвергаемых хроматографическому разделению. Такая бифункциональность часто приводит к образованию «хвостатых» пиков. Поэтому реакция прививки обращенной фазы не исключает необходимости последующей инактивации оставшихся силанольных групп диметилдихлорсиланом и метанолом, описанной выше.

Поверхность алкилированного силикагеля представляет собой своеобразную щетку из линейных алкильных цепочек (рис. 7.6).

 

Рис. 7.6. Участок поверхности силикагеля C₁₈.

 

Сор­бенты в обращенно-фазовой ВЭЖХ быстро приходят в равновесие при изменении состава растворителя, что позволяет, достаточно легко переходить от одной методики к другой с использованием одной и той же колонки, а также применять градиентное элюирование с быстрым восстановлением равновесия сорбента с исходным растворителем. Эти сорбенты дают возможность использовать растворители в широком диапазоне изменения их свойств, а также добавки разных типов (соли, кислоты и основания, ион-парные реагенты, органические модификаторы и т.п.).

Однако в обращенно-фазовой хроматографии существуют и некоторые проблемы, связанные с плохой воспроизводимостью получения обращенно-фазовых сорбентов. Емкость и селективность меняются не только при переходе от сорбента одного производителя к сор­бенту другого (например, от Сферисорба ОДС к Партисилу ОДС), формально определяемых как идентичные (силикагель с привитыми октадецилсилильными группами). Эти характеристики меняются более или менее значительно даже при переходе от одной пар­тии сорбента к другой партии того же производителя. Причины этого связаны как с тем, что исходные силикагели заметно различаются по поверхности, объему и размеру пор, так и с тем, что для прививки неподвижных фаз, которые далее называют одинаково, применяют разные агенты.

Из этого обсуждения следует важный вывод: ни один сорбент, как бы хорош он ни был по химии поверхности и технологии получения, не может быть использован для воспроизведения любых методик или решения любых аналитических задач. Исследователь всегда должен располагать возможностью использовать достаточно широкую группу сорбентов для решения возникающих перед ним аналитических задач. Поэтому на вопрос, который обычно задают начина­ющие хроматографисты: какой обращенно-фазовый сорбент является наилучшим? — ответить однозначно не удается даже исследователю, имеющему большой опыт работы.

В настоящее время фирмы-производители выпускают более 100 разных обращенно-фазовых сорбентов. Наиболее массово выпускаются сорбенты с привитыми неподвижными фазами С₈ и С₁₈. Так как емкость этих сорбентов пропорциональ­на содержанию привитого углерода (точнее, той части приви­того углерода, которая доступна для взаимодействия с моле­кулами разделяемых веществ), то для сорбентов одной торговой марки удерживание соединений в обращенно-фазовой хроматографии увеличивается в ряду С₂ < С₄ < С₈ < С₁₈.

Одна из причин, способствовавших быстрому росту приме­нения обращенно-фазовых сорбентов в ВЭЖХ, — это их способ­ность четко разделять серии гомологов в порядке возрастания их молекулярной массы, делающая их в этом сходными с популярными в газовой хроматографии полиметилсилоксановыми неподвижными фазами. При этом гомологи могут, в отличие от разделяемых методами ад­сорбционной или нормально-фазовой хроматографии, не иметь в своем составе полярных функциональных групп. Обращенно-фазовые сорбенты позволяют четко разделить гексан и гептан, бензол и толуол, фенол и п -крезол, трет. -бутилтолуол и трет. -пентилтолуол. Это вовлекает в область анализа методом ВЭЖХ такие важные объекты, как углеводороды нефти, продукты нефтепереработки (бензины, ке­росины, газойли, смазочные масла, ароматические углеводоро­ды), продукты переработки сланцев и углей - очень важные многотоннажные продукты в промышленности. Если нужно разделить вещества неполярные или малополярные, практически любой обращенно-фазовый сорбент может при относительно простом подборе растворителя обеспе­чить хорошее разделение.

Растворители, используемые в обращенно-фазовой хроматографии (ацетонитрил, метанол, вода, в меньшей мере — тетрагидрофуран), относительно легко растворяют все важнейшие группы веществ, входящих в состав живых организмов, биологических объектов, лекарственных препаратов, пестицидов, гербицидов, продукты органической хи­мии, нефтехимии, биоорганической химии и др. (рис. 7.6, 7.7).

 

Рис. 7.6. Хроматограмма смеси ароматических углеводородов, полученная на колонке размером 250×4.6 мм с Зорбаксом ОДС (6 мкм), подвижная фаза: смесь метанол—вода (90:10 по объему), расход 1.5 мл/мин, УФ-детектор (254 нм), объем пробы 20 мкл: 1 – толуол; 2 – о -ксилол; 3 – трет.- бутилбензол; 4 – п-трет. -бутилтолуол; 5 – п-трет. -пентилтолуол; 6 — п-трет. -гексилтолуол; 7 – 3,5-ди- трет. -бутилтолуол; 8 – трет. -гексил- о -ксилол [12].

 

Рис. 7.7. Хроматограмма снотворных лекарств полученная на колонке размером 250´4 мм с Нуклеосилом C₁₈ (10 мкм), подвижная фаза: смесь метанол—вода (55:45 по объему), расход 3.5 мл/мин, давление 14 МПа, УФ-детектор (254 нм), объем пробы 5 мкл: 1 — примесь; 2 — веронал; 3 — люминал: 4 — проминал; 5 — ревонал; 6 — примесь; 7 — тиогенал [12].

 

Эти растворители позволяют работать в широком УФ-диапазоне, так как они обладают хорошей прозрачностью, начиная с коротких длин волн порядка 190—210 нм (тетрагидрофуран — с 220 нм). Это позволяет применять УФ-фотометр как неселективный универсальный детектор для анализа сахаров, жиров, сложных эфиров, спиртов, олефинов.

В качестве растворителей дляВЭЖХ ис­пользуют преимущественно воду, метанол и ацетонитрил. Другие спир­ты, кроме метанола, используют редко, так как их вязкость значительно выше и при работе с ними требуется слишком большое давление, тогда как эффективность разделения падает вследствие более медленной, чем у метанола, диффузии в подвижной фазе. Ацетонитрил имеет ряд преимуществ перед метанолом. При хорошей очистке он лучше пропускает свет в ультрафиолетовом диапазоне (ниже 210 нм) и позволяет работать в сме­си вода — ацетонитрил при 200 и даже при 190 нм. Он обычно об­ладает лучшими растворяющими свойствами для проб, чем ме­танол. Большая вязкость смесей метанол—вода по сравнению со смесями ацетонитрил—вода (почти в 1,5 раза) за­трудняет использование колонок, заполненных частицами сорбентов размером 3 и 5 мкм, при использовании водно-метанольных смесей. Наконец, важную роль играет и то обстоятель­ство, что метанол относится к группе особо опасных ядов, нахо­дящихся на строгом контроле и учете, тогда как ацетонитрил к этой группе веществ не относится. К недостаткам ацетонитрила относятся его довольно высокая стоимость (особенно высокочистых сортов, предназначенных для ВЭЖХ и УФ-спектроскопии), некоторая токсичность, требующая пред­осторожностей при работе.

Особо следует сказать о качестве воды и о требованиях к ней. Вода, являющаяся в настоящее время одним из важней­ших растворителей для ВЭЖХ, является как самым доступным, так и очень трудным для тщательной очистки растворителем. Если для изократических разделений, особенно при использовании не очень чувствительных детекторов или при работе не в ближнем УФ-диапазоне, удается обойтись бидистиллятом (не деионизированной водой!), то для градиентных разделений и для работы с вы­сокочувствительными детекторами такого качества воды уже недостаточно. Деионизированная вода без дальнейшей очистки не подхо­дит для использования в ВЭЖХ: органические иониты обогащают воду продуктами собственной деструкции. Удалить все органические соединения из воды очень трудно, особенно микроколичества — никакая перегонка или ректификация не эффективны, вследствие образования азеотропных смесей.

Существуют системы высокой очистки воды, осуществляю­щие деионизацию с последующим извлечением органических соединений адсорбентами. В том случае, если таких систем или пат­ронов в распоряжении исследователя нет, следует взять наиболее чистую воду, имеющуюся в лаборатории, и пропустить ее через колонку, заполненную чистым обращенно-фазовым сор­бентом с привитой неподвижной фазой С₁₈. Все органическое примеси из воды будут сорбироваться в начале колонки, а на выходе колонки будет получаться чистая вода без примесей. После пропускания определенного объема воды, зависящего от количества органических загрязнений в ней, эту колонку промывают чистым метанолом или ацетонитрилом, смывая загрязнения, после чего она снова будет го­това к работе. Высокочистая вода нестабильна при хранении, поэтому лучше ее исполь­зовать свежеприготовленную.

Работая в градиентном режиме с водно-метанольными и водно-ацетонитрильными растворами, следует ежедневно дегазировать растворители наилучшим из возможных способов, особенно, если используют градиент на стороне низкого давле­ния.

Возвращаясь к схеме жидкостного хроматографа (см. рис. 7.1), отметим, что обычно в качестве одного из растворов (Eluent 1) используют воду или водный буферный раствор с определенным значением рН, а в качестве другого (Eluent 2) – полярный растворитель (метанол, ацетонитрил и др.) или полярный растворитель с добавкой модификатора, обычно — детергента, определяющего свойства поверхности НФ. Следует иметь ввиду, что смешение водно-солевых (буферных) растворов с органическими растворителями может приводить к понижению растворимости и выпадению осадка. Чтобы этого избежать, необходимо тщательно спланировать ход эксперимента.

ВЭЖХ с полярными фазами, ион-парная хроматография. Наряду с неполярными привитыми фазами, выпускаемыми специально для обращенно-фазовой хроматографии, в обращенно-фазовом варианте (по используемому типу подвижных фаз) часто используют нитрильную и аминную привитые фазы, а иногда и диольную, — которые обычно применяются в нормально-фазовом варианте ВЭЖХ. В таком гибридном случае они ра­ботают и разделяют вещества в основном по обращенно-фазовому механизму, как имеющие короткий (С₃) привитый алкилсилан, а полярные группы или вообще не влияют (при разделении смесей слабополярных веществ), или корректируют селективность тем сильнее, чем выше полярность аналитов.

Главное применение ВЭЖХ с полярными фазами — определение сильнополярных и ионогенных соединений. Например, на силикагеле, модифицированном аминогруппами, получают хорошее разделение моносахаридов, органических кислот и т.п. При определении ионогенных веществ элюирующую способность ПФ изменяют, регулируя значение рН или вводя добавки ионных веществ — ион-парных реагентов. Оба этих приема служат для того, чтобы превратить разделяемые вещества в нейтральные частицы, способные удерживаться на НФ. В методе ион-парной хроматографии определяемые ионы переводят в ионные пары, добавляя в ПФ гидрофобный противоион. Если такой ион имеет свойства поверхностно-активного вещества (ПАВ), то он в избытке присутствует вблизи поверхности обращенно-фазового сорбента и играет роль модификатора НФ. Этот вариант ион-парной хроматографии является ВЭЖХ на жидких, или динамически покрытых ионообменниках.

Регулирование рН позволяет перевести вещества основного или кислотного характера в ту или иную равновесную форму, удерживание которой отличается от удерживания других форм. Управление хроматографическим поведением веществ с помощью изменения рН называется методом хроматофокусирования.

К методам ВЭЖХ с полярными фазами относится и вариант ионообменной хроматографии, называемый еще одноколоночным вариантом ионной хроматографии, в котором применяются низкоемкие высокоэффективные анионообменники или динамически покрытые жидкими анионообменниками обращенные фазы, а в качестве ПФ используются сильно разбавленные буферные растворы ароматических кислот или других малоподвижных анионов. Применяемый в этом методе кондуктометрический детектор формирует полезный сигнал, равный разности электропроводностей разделяемых аналитов и элюента. Возможно также косвенное спектрофотометрическое детектирование. Метод одноколоночной ионной хроматографии может быть применен и для определения катионов, однако в этом случае в качестве детектирующей системы удобнее использовать послеколоночную дериватизацию и спектрофотометрическое детектирование.

 

Таким образом, в общем случае ПФ в ВЭЖХ представляет собой смесь, содержащую растворители, добавки для управления параметрами среды (например, электролиты для создания нужного значения рН) и модификаторы для управления селективностью и емкостью НФ.

Работа с анализируемым образцом.

Для оценки полярности органических молекул анализируемой пробы можно использовать критерий гидрофобности Шатца [11]:

, (7.1)

где — число углеводородных звеньев в молекуле, — число функциональных групп (включая карбоксильную). Для низко-гидрофобных молекул характерны значения критерия 0 - 4, а для высоко-гидрофобных — 20 - 60.

На рис. 7.8 показана схема, позволяющая выбрать в рамках ВЭЖХ метод анализа образца по его полярности.

 

Рис. 7.8. Схема выбора метода по полярности анализируемого образца.

 

Рассмотрим, например, левую ветвь схемы на рис. 7.8. Если образец растворяется в полярном растворителе, необходимо ответить на вопрос, относятся ли анализируемые соединения к числу ионогенных. В отсутствие информации такого рода в первую очередь применяют обращенно-фазовую ВЭЖХ. Если в условиях разделения проба содержит ионогенные соединения, о чем свидетельствуют низкие значения времени удерживания и соответственно неудовлетворительное разделение, то для увеличения времени удерживания в ПФ добавляют ион-парные реагенты противоположной аналитам полярности. Преимущество такого хода анализа состоит в том, что одна и та же колонка пригодна как для обращенно-фазовой, так и для ион-парной хроматографии.

Дериватизация пробы.

В ВЭЖХ широко применяется способ пробоподготовки под названием дериватизация. Этим способом может быть изменена полярность соединения, увеличена чувствительность его детектирования, а отклик может стать более селективным. Дериватизация применяется для селективного определения веществ, относящихся к одному классу. Например, аминокислоты дериватизируют в гидролизатах белка реакцией с дансилхлоридом (1-диметиламинонафталин-5-сульфонилхлоридом), при этом получаются флуоресцирующие соединения (рис. 7.9).

Рис. 7.9. Дериватизация аминогруппы аминокислоты или пептидного остатка () с использованием дансилхлорида с образованием флуоресцирующего производного (деривата).

 

⇐ Предыдущая6789101112131415Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: