 |
Элюирующая способность подвижной фазы
|
|
|
|
Элюотропный ряд – это перечень индивидуальных растворителей расположенных в порядке возрастания элюирующей способности, которая может быть охарактеризована различными параметрами. В качестве таких параметров используют:
– относительную энергию взаимодействия молекул подвижной фазы с поверхностью адсорбента ε0;
– параметр Р’ растворителя (параметр Снайдера), который с точностью до постоянной равен сумме логарифма молярного объема растворителя и логарифмов коэффициентов распределения стандартных веществ (этанола, диоксана и нитрометана) между паровой фазой и испытуемым растворителем [14];
– параметр S, который равен коэффициенту в линейном члене зависимости логарифма удерживания аналита в рассматриваемых условиях от доли органической добавки в водном элюенте, т.е. отражает чувствительность величин удерживания к изменению состава ПФ. Эта величина предложена для обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Свойства растворителей, используемых в ВЭЖХ приведены в табл. 7.1. Основой всех способов классификации селективности является различная способность растворителей вступать в межмолекулярные взаимодействия различных типов, представление интегрального параметра элюирующей силы в виде суммы парциальных величин, характеризующих протонодонорные, протоноакцепторные, диполь-дипольные и некоторые другие свойства растворителей. Снайдер разбил 81 исследованный растворитель на восемь классов, которые определенным образом располагаются в треугольнике селективности (рис. 7.10). Его вершинам отвечают гипотетические растворители, способные к взаимодействиям только одного типа: Хе – протонодонорным (свойство этанола «e»), Хd – протоноакцепторным (свойство диоксана «d») и Хn – диполь-дипольным (свойство нитрометана «n»). Окружности в его пределах изображают области соответствующие реально существующим растворителям, поделенным на восемь групп селективности: I – алифатические простые эфиры, амины; II – алифатические спирты; III – пиридины, тетрагидрофуран, амиды (кроме формамида); IV – гликоли, уксусная кислота, формамид; V – метиленхлорид, этиленхлорид; VI – алифатические кетоны и сложные эфиры, диоксан, сульфоны, нитрилы; VII – ароматические углеводороды, нитросоединения; VIII – фторированные спирты, вода, хлороформ.
|
|
|
Таблица 7.1. Свойства растворителей для ВЭЖХ
| Растворитель | Предел прозрачности в УФ-диапазоне, нм | Элюирующая сила на силикагеле ε0 | Параметр P’ | Параметр S | Группа селективности |
| Ацетонитрил | 0,50 | 5,8 | 3,1 | VI | |
| Вода | - | 1.50 | 10.2 | 0,0 | VIII |
| Гексан | 0,01 | 0,1 | - | - | |
| Диоксан | 0,45 | 4.8 | 3,5 | VI | |
| Метанол | 0,7 | 5,1 | 3.0 | II | |
| Метиленхлорид | 0,32 | 3,1 | - | V | |
| Пропанол-2 | 0,55 | 3,9 | 4,2 | II | |
| Тетрагидрофуран | 0.44 | 4,0 | 4,4 | III | |
| Толуол | 0,1 | 2,4 | - | VII | |
| Триэтиламин | - | - | 1,9 | - | I |
| Уксусная кислота | - | - | 6,0 | - | VI |
| Хлороформ | 0,26 | 4,1 | ~VIII | ||
| Этанол | 0,6 | 4,3 | -3,6 | II | |
| Этилацетат | 0,38 | 4,4 | VI |
Рис. 7.10. Классификация растворителей по Снайдеру. Кругами выделены области, в которых группируются растворители по селективности: Xe – способность к протонодонорным взаимодействиям; Xd – способность к протоноакцепторным взаимодействиям; Xn – способность к диполь-дипольным взаимодействиям. AB, CD и EF — тренды изменения способности к соответствующим взаимодействиям.
Детекторы
Как и в других хроматографических методах, в ВЭЖХ используют прежде всего неизбирательные, но также и селективные методы детектирования. Например, все вещества, растворенные в ПФ, по-разному преломляют свет; это свойство лежит в основе универсального детектирования – рефрактометрии. Амперометрическое детектирование практически так же неизбирательно по отношению к электрохимически окисляемой органике. Более избирательными являются методы фотометрии; еще более селективны флуоресцентные методы. Все в большей степени применяется гибридный метод хромато-масс-спектрометрии – универсальный (по суммарному току) и селективный (по масс-спектру каждого компонента) одновременно.
|
|
|
Рефрактометрический детектор (РМД).
В основе рефрактометрического детектирования лежит измерение показателя преломления подвижной фазы. Детектирование универсально и применимо ко всем веществам. Необходимым является условие существенного различия показателей преломления чистого элюента и аналита. Для измерения показателя преломления используют оптическую схему, главным элементом которой является призма с каналом для ПФ. Измеряется угол отклонения пучка света, проходящего через канал с ПФ. Метод измерения разностный (дифференциальный), поэтому чувствительность невысока. Результат сильно зависит от температуры; для устранения погрешности такой природы необходимо термостатирование с точностью 10-3 градуса, что крайне неудобно. РМД применяют в тех случаях, когда отсутствуют эффекты фотопоглощения, например, при определении сахаров.
Фотометрический детектор, работающий в УФ- и видимом спектральном диапазоне.
Проточные фотометры, работающие в УФ-диапазоне, являются в настоящее время наиболее распространенными детектирующими устройствами, применяемыми в жидкостной хроматографии. Это связано с их относительно небольшой стоимостью в сочетании с высокой чувствительностью и надежностью в работе. Эти детекторы могут проработать более 6000 часов. С другой стороны, стороны этим детекторам присуща относительно малая чувствительность к флуктуациям температуры, скорости подвижной фазы и изменениям ее состава. Принципиальная схема простейшего фотометрического детектора представлена на рис. 7.11.
Рис. 7.11. Принципиальная схема УФ-фотометрического детектора: 1 – фотоприемники; 2 – рабочая кювета; 3 – оптические фильтры; 4 – ртутная лампа; 5 – сравнительная кювета.
|
|
|
Поток элюента протекает через рабочую ячейку, а через сравнительную ячейку направляется поток чистой подвижной фазы. Источником УФ-света служит ртутная лампа высокого или среднего давления, дающая интенсивное УФ-излучение в спектральных линиях линейчатого спектра. Свет с нужной длиной волны выделяется с помощью подходящих оптических фильтров. Ртутные лампы низкого давления излучают более 90% световой энергии в спектральной линии с длиной волны 254 нм, что позволяет отказаться от использования оптических фильтров. В ряде случаев в фотометрическом детекторе используют излучение с длиной волны 280 нм, возбуждаемое с помощью подходящих люминесцентных экранов. В ряде конструкций фотометрических детекторов такое излучение используют во вспомогательном канале детектирования, облегчающем идентификацию неизвестных соединений. Имеются и другие лампы, в сочетании с подходящими оптическими фильтрами излучающие УФ-свет с другими длинами волн (206, 214, 229, 280, 313, 334 и 365 нм). такие лампы могут бесперебойно работать от 500—600 до 60000 час.
Многие органические вещества интенсивно поглощают УФ-излучение с длиной волны 254 нм. К ним относятся все ароматические и многие гетероциклические соединения, карбонильные соединения и многие другие. Для детектирования таких соединений применение простых, недорогих и надежных фотометрических детекторов вполне оправдано. Чувствительность этих детекторов достаточно высока и позволяет регистрировать изменения оптической плотности в диапазоне порядка 0.001-0.002 единицы. Шумы и дрейф таких детекторов также незначительны. Ячейки этих детекторов могут иметь собственный объем от 0,2—2 мкл для работы с микроколонками до 10 мкл и более для проведения более крупномасштабных препаративных разделений. Все эти обстоятельства сделали фотометрические детекторы одними из наиболее часто применяемыми в высокоэффективной жидкостной хроматографии в настоящее время.
Наиболее совершенные УФ-детекторы содержат набор подходящих фотодиодов, образующих так называемую диодную матрицу или диодную линейку. УФ-излучение с непрерывным спектром (например, излучение дейтериевой лампы) после выхода из рабочей ячейки детектора разделяется на отдельные лучи с той или иной длиной волны, каждый из которых направляется на свой отдельный фотодиод. Таким образом, по-существу, фиксируется УФ-спектр каждого вещества, элюируемого из хроматографической колонки. В наиболее совершенных современных хроматографах используются диодные линейки, содержащие 32, 64, 128 и более диодов.
|
|
|
В сочетании с многоканальными усилителями или с компьютерами такие детекторы позволяют одновременно регистрировать целый набор хроматограмм зафиксированных в разных длинах волн. УФ-детектор с диодной матрицей представляет собой наибольшее из известных приближение к универсальному детектору, позволяющему получить очень большой объем информации о качественном и количественном составе анализируемой смеси в результате всего лишь одного хроматографического эксперимента. Такие детекторы довольно дороги, однако они оказываются исключительно полезными при анализе смесей, сложных по своему составу смесей.
Флуоресцентные (флуориметрические) детекторы.
Эти детекторы используют способность многих органических и неорганических соединений к флуоресценции под действием различных излучений. Флуоресценция — это способность испускать свет под действием ультрафиолетового или видимого света. Флуоресцентные свойства веществ могут определяться с очень высокой чувствительностью.
Интенсивность флуоресценции зависит от интенсивности излучения вызывающего флуоресценцию и от квантового выхода процесса возбуждения молекул. Для обеспечения высокой чувствительности флуоресцентных детекторов применяются достаточно мощные источники возбуждающего излучения (газоразрядные лампы и лазеры). Чувствительность флуоресцентных детекторов с лазерным возбуждением позволяет регистрировать присутствие некоторых флуоресцирующих соединений на уровне 10-12 г (=1 пг) и менее. Такая чувствительность превышает чувствительность детекторов по светопоглощению на несколько порядков. Некоторые современные флуоресцентные детекторы позволяют по усмотрению экспериментатора выбирать длину волны возбуждающего и испускаемого излучения, что предоставляет дополнительные возможности идентификации пиков на хроматограммах.
Флуоресцентный детектор имеет проточную ячейку с двумя взаимно перпендикулярными оптическими каналами. Один из них служит для подвода возбуждающего излучения, а другой позволяет измерять интенсивность флуоресценции.
|
|
|
Чувствительность флуоресцентных детекторов может уменьшаться при увеличении концентрации изучаемого раствора вследствие явления внутреннего тушения флуоресценции. Поэтому, в основном, флуоресцентные детекторы применяются для определения следовых концентраций способных к флуоресценции соединений. Линейный диапазон этих детекторов достаточно широк (около 104), однако для некоторых соединений он может быть ограничен довольно узким диапазоном концентраций. Поэтому при использовании такого детектора требуется тщательное предварительное изучение его характеристик до проведения с его помощью количественных определений. При этом необходимо проверить отсутствие фоновой люминесценции и эффектов тушения излучения и, кроме того, провести градуировку детектора в области реальных концентраций для конкретных соединений, подлежащих количественному определению.
Кислород- и галогенсодержашие ПФ обладают способностью к тушению флуоресценции и поэтому не могут применяться в сочетании с этим детектором. Аналогично, не могут быть использованы растворители с недостаточной прозрачностью для излучений возбуждения или флуоресценции.
Сигнал флуоресцентных детекторов лишь в малой степени зависит от изменений температуры и давления. Эти детекторы могут быть использованы в условиях градиентного элюирования при условии, что применяемые растворители не флуоресцируют сами и не содержат флуоресцирующих примесей.
Некоторые вещества, не обладающие сами по себе способностью к флуоресценции, могут быть зарегистрированы этим детектором после перевода в флуоресцирующие производные, которые могут быть получены до проведения хроматографического разделения или после него с помощью реакций дериватизации с подходящим флуорогенным реагентом. Так, например, амины и фенолы образуют флуоресцирующие производные с 5-диметиламино-1-нафтилсульфохлоридом, а аминокислоты после хроматографического разделения переводят в флуоресцирующие производные реакцией с флуорескамином. Такие приемы позволяют существенно расширить возможности этого очень чувствительного и во многих случаях специфичного метода детектирования на многие важные группы соединений, не обладающих собственной способностью к флуоресценции. Флуоресцентный детектор является одной из наиболее важных детектирующих систем для ВЭЖХ в области медико-биологических исследований и контроля загрязнений окружающей среды.
Электрохимический (амперометрический) детектор.
Вещества, обладающие электрохимической активностью, то есть способные к электрохимическому окислению или восстановлению, могут быть с успехом зарегистрированы с помощью электрохимического детектора. Потенциал электрохимического окисления или восстановления варьирует от –0,8 В до +1,2 В. Вещества, содержащие фенольные, индольные или альдегидные группировки, способны окисляться при более низких потенциалах порядка 0,4—0,7 В. Имеющие важное значение для биохимии катехоламины и 5-оксииндолы также могут окисляться в тех же условиях, тогда как кетоны и соединения, содержащие нитрогруппы, в этих условиях восстанавливаются. Процессы окисления и восстановления веществ связаны с потерей или приобретением электронов, что приводит к появлению малых электрических токов, которые далее усиливаются и регистрируются с помощью соответствующих электронных устройств.
Ячейки большинства широко используемых электрохимических детекторов представляют собой миниатюрные камеры с расположенным в их центре единственным рабочим электродом, выполненным из стеклоуглерода. Вспомогательный электрод и электрод сравнения помещаются вне рабочей ячейки на ее выходе (рис. 7.12). Рабочая площадь электрода составляет всего лишь 2—4 мм2.
Этот детектор работает в потоке водных или водно-органических подвижных фаз, обладающих достаточной электропроводностью (буферные растворы, водно-спиртовые смеси с растворенными солями и т.п.). Электрохимический детектор проявляет высокую селективность при низких электродных потенциалах. Так, для детектирования 5-оксииндолов наилучшее значение потенциала равно 0,5—0,55 В, для катехоламинов – 0,5—0,7 В, а для пептидов – 0,9—1,2 В. Чувствительность электрохимических детекторов очень высока: предельно обнаруживаемая концентрация катехоламинов и 5-оксииндолов составляет 5—20 пг вещества в пробе. Помимо двух упомянутых групп соединений, электрохимический детектор находит применение при определении серотонина, ацетилхолина, их производных и метаболитов, нейропептидов, многих других биологически активных и лекарственных веществ. Он также может применяться при анализе фенолов, ароматических аминов, тиоспиртов, аскорбиновой кислоты, мочевой кислоты и многих других соединений в условиях электрохимического окисления. Возможно применение детекторов этого типа для детектирования хинонов, нитросоединений, металлорганических соединений и многих других веществ.
Рис. 7.12. Конструкция электродной ячейки электрохимического детектора: 1 – вход элюата из колонки; 2 – выход элюата к электродам сравнения и вспомогательному; 3 – тефлоновая прокладка; 4 – рабочая камера ячейки; 5 – рабочий электрод; 6 – основание ячейки.
Лекция 9
|
|
|
