 |
Особенности приготовления препарата
|
|
|
|
| 1. Взятие материала и фиксация | Материал берут очень маленькими кусочками (порядка 1 мм 3), а фиксацию осуществляют обычно в 2 стадии:
 вначале глутаральдегидом (стабилизация белков),
затем - четырёхокисью осмия (стабилизация фосфолипидов и контрастирование ткани).
|
| 2. Уплотнение материала | 1. Образцы, как обычно, обезвоживают, а для их дальнейшего уплотнения используют эпоксидные смолы. 2. а) Заливку производят в специальных формах, б) затвердевание смеси происходит путём её полимеризации в термостате, в) и затвердевшие блоки имеют вид маленьких свечей. |
| 3. Приготовление срезов | 1. Срез делают с помощью ультратома; их толщина - 30-50 нм (ср. с микротомными срезами - 10.000 – 20.000 нм). 2. Затем их переносят на сеточки (играющие роль предметного стекла). |
| 4. Окрашивание срезов | 1. а) Окрашивание срезов сводится к их контрастированию с помощью солей тяжёлых металлов (свинца, вольфрама, урана). б) Эти соли осаждаются на фосфолипидах мембран и поглощают электроны. 2.Поэтому соответствующие места клетки выглядят более тёмными. |
n 15. Растровый электронный микроскоп (РЭМ) широко используется в научно-исследовательских лабораториях.
По своим техническим возможностям он сочетает в себе качества как светового (СМ), так и просвечивающего электронного (ПЭМ) микроскопов, но является более многофункциональным.
В основе РЭМ лежит сканирование поверхности образца электронным зондом и детектирование (распознавание) возникающего при этом широкого спектра излучений. Сигналами для получения изображения в РЭМ служат вторичные, отраженные и поглощённые электроны.
Принцип действия РЭМ основан на использовании некоторых эффектов, возникающих при облучении поверхности объектов тонко сфокусированным пучком электронов – зондом. В результате взаимодействия электронов с образцом (веществом) генерируются различные сигналы.
|
|
|
16. Атомно-силовая микроскопия — один из видов сканирующей зондовой микроскопии, основанный на ван-дер-ваальсовских взаимодействиях зонда с поверхностью образца. Принцип действия атомного силового микроскопа (АСМ) основан на использовании сил атомных связей, действующих между атомами вещества. На малых расстояниях между двумя атомами действуют силы отталкивания, а на больших – силы притяжения. Совершенно аналогичные силы действуют и между любыми сближающимися телами. В сканирующем атомном силовом микроскопе такими телами служат исследуемая поверхность и скользящее над нею острие. Обычно в приборе в качестве зонда используется игла с площадью острия в один или несколько атомов, закрепленная на кантилевере, который плавно скользит над поверхностью образца. На выступающем конце кантилевера (над шипом) расположена зеркальная площадка, на которую падает и от которой отражается луч лазера. Когда зонд опускается и поднимается на неровностях поверхности, отраженный луч отклоняется, и это отклонение регистрируется фотодетектором, а сила, с которой шип притягивается к близлежащим атомам – пьезодатчиком. Данные фотодетектора и пьезодатчика используются в системе обратной связи, которая может обеспечивать, например, постоянную величину силу взаимодействия между микрозондом и поверхностью образца. В результате, можно строить объёмный рельеф поверхности образца в режиме реального времени. Разрешающая способность данного метода составляет примерно 0,1-1 нм по горизонтали и 0,01 нм по вертикали.
Кантилевер (от англ. cantilever – консоль, балка) — одна из основных составных частей сканирующего зондового микроскопа представляет собой массивное прямоугольное основание, размерами примерно 1,5×3,5×0,5 мм, с выступающей из него балкой (собственно кантилевером), шириной порядка 0,03 мм и длиной от 0,1 до 0,5 мм. На нижнем конце кантилевера располагается игла, взаимодействующая с образцом. Радиус острия иглы промышленных кантилеверов находится в пределах 5—90 нм, лабораторных — от 1 нм.
|
|
|
Верхняя сторона кантилевера над иглой является зеркальной для отражения лазерного луча. В некоторых случаях для улучшения отражающей способности кантилевера на него напыляют тонкий слой алюминия. По своей структуре кантилевер чаще всего представляет собой монокристалл кремния или нитрида кремния. Игла также может быть из кремния, нитрида кремния или алмаза.
В зависимости от расстояний от иглы до образца возможны следующие режимы работы атомно-силового микроскопа:
· контактный режим (contact mode);
· бесконтактный режим (non-contact mode);
· полуконтактный режим (tapping mode).
При контактном режиме расстояние от иглы до образца составляет порядка нескольких десятых нм. Таким образом, игла находится в мягком физическом контакте с образцом и подвержена действию сил отталкивания. В этом случае взаимодействие между иглой и образцом заставляет кантилевер изгибаться, повторяя топографию поверхности. Топографические изображения в атомно-силовом микроскопе обычно получают в одном из двух режимов:
· режим постоянной высоты
· режим постоянной силы.
При бесконтактном режиме (режиме притяжения) кантилевер с помощью пьезокристалла колеблется над изучаемой поверхностью с амплитудой ~2 нм, превышающей расстояние между зондом и поверхностью. По изменению амплитуды или сдвигу резонансной частоты колебаний в ходе сканирования поверхности определяется сила притяжения и формируется изображение поверхности. Полуконтактный режим аналогичен бесконтактному режиму с тем отличием, что игла кантилевера в нижней точке своих колебаний слегка касается поверхности образца. При использовании атомно-силовой микроскопии в нанолитографии работа ведется в контактном режиме с контролируемым перемещением острия зонда по заданной схеме. При использовании специальных кантилеверов можно также изучать электрические и магнитные свойства поверхности.
|
|
|
Основные технические сложности при создании микроскопа:
· Создание иглы, заострённой действительно до атомных размеров.
· Обеспечение механической (в том числе тепловой и вибрационной) стабильности на уровне лучше 0,1 ангстрема.
· Создание детектора, способного надёжно фиксировать столь малые перемещения.
· Создание системы развёртки с шагом в доли ангстрема.
· Обеспечение плавного сближения иглы с поверхностью.
В сравнении с растровым электронным микроскопом атомно-силовой микроскоп обладает рядом преимуществ. Атомно-силовая микроскопия позволяет получить истинно трёхмерный рельеф поверхности. Кроме того, изучаемая поверхность не требует нанесения проводящего металлического покрытия, которое часто приводит к заметной деформации поверхности. Для нормальной работы растрового электронного микроскопа требуется вакуум, в то время как большинство режимов атомно-силовой микроскопии могут быть реализованы на воздухе или даже в жидкости. Данное обстоятельство открывает возможность изучения биомакромолекул и живых клеток.
К недостаткам атомно-силовоймикроскопии следует отнести небольшой размер поля сканирования. Максимальный перепад высот составляет несколько микрон, а максимальное поле сканирования в лучшем случае составляет порядка 150×150 микрон. Другая проблема заключается в том, что при высоком разрешении качество изображения определяется радиусом кривизны кончика зонда, что при неправильном выборе зонда приводит к появлению артефактов на получаемом изображении.
Обычный атомно-силовой микроскоп не в состоянии сканировать поверхность также быстро, как это делает растровый электронный микроскоп. Для получения изображения, требуется от нескольких минут до нескольких часов, в то время как растровый электронный микроскоп после откачки способен работать практически в реальном масштабе времени, хотя и с относительно невысоким качеством. Из-за низкой скорости развёртки атомно-силового микроскопа получаемые изображения оказываются искажёнными тепловым дрейфом, что уменьшает точность измерения элементов сканируемого рельефа. Кроме термодрейфа получаемые изображения могут также быть искажены из-за таких свойств пьезокерамики, как нелинейность, крип и гистерезис и перекрёстными паразитными связями, действующими между X, Y, Z-элементами сканера. Для исправления искажений в реальном масштабе времени современные атомно-силовые микроскопы используют программное обеспечение (например, особенность-ориентированное сканирование) либо сканеры, снабжённые замкнутыми следящими системами, в состав которых входят линейные датчики положения. Некоторые микроскопы вместо сканера в виде пьезотрубки используют XY и Z-элементы, механически несвязанные друг с другом, что позволяет исключить часть паразитных связей.
|
|
|
17. Фиксация. Цели фиксации:
• Предотвращение процессов гниения
• Предотвращение аутолиза
• Предотвращение высыхания
• Сохранение прижизненной структуры клеток и межклеточного матрикса
Виды фиксации
• Термическая • Химическая
Фиксация мазков крови
• Приготовить мазок
• Дать высохнуть при комнатной температуре (ок. 2 часов)
• Погрузить в фиксирующую жидкость
• Дать высохнуть фиксированному препарату (10 мин.)
Фиксирующая жидкость Время фиксации
Абсолютный ацетон 1-3 мин.
Абсолютный метанол 1-3 мин.
96% этанол 25-30 мин.
Смесь Никифорова (этанол+диэтиловый эфир, 1:1) 25-30 мин.
|
|
|
