Правила и возможные ошибки при изготовлении срезов

22. Криостат - специализированная холодильная камера с установленным в ней микротомом, в которой имеются отверстия для рук, люминесцентная лампа и смотровое стекло. Надежная изоляция позволяет поддерживать в криостате температуру от -5 до -25 °С. Отрицательными моментами при работе с криостатом являются значительное переохлаждение рук оператора, недостаточная освещенность рабочего поля, а также невозможность ориентировать объект относительно кромки ножа.

Существуют также физические способы фиксации материала, наиболее распространенным из которых является быстрое замораживание кусочка органа с помощью жидкого азота и других средств. Для резки замороженного материала используют специальные приборы — криостаты, или замораживающие микротомы.

для получения качественного замороженного среза необходимым условием является быстрое замораживание ткани, при котором вода не кристаллизуется, а переходит в состояние аморфного льда.

Скорость замораживания, в первую очередь, ограничивается скоростью теплопереноса. Ткань биопсийного материала сама по себе обладает низкой теплопроводностью. Поэтому быстро и равномерно охладить образец большого объема без повреждений невозможно. Для обеспечения максимальной скорости охлаждения биоптат следует замораживать в жидкой среде. Эта жидкость (хладагент) должна иметь точку плавления ниже температуры инициации кристаллизации воды - 70°С. Этому требованию удовлетворяет ряд алканов - это пентан, 2-метилбутан (изопентан), n-гексан, гептан.

Поставленная в работе цель, таким образом, достигается путем замораживания ткани в n-гексане, охлажденном до температуры плавления (-95°С), в форме пластинки толщиной не более 3 мм и изготовлением из нее в криостате срезов толщиной менее 7 мкм по стандартной методике, с последующей быстрой фиксацией и окраской.

 

23. Криоэлектронная микроскопия Наряду с методами химической фиксации образца при комнатной температуре применяются методы криоэлектронной микроскопии.

Метод криофиксации состоит всего из трех этапов: криопротекция и быстрое замораживание (в жидком· азоте) лиофилизация· получение замороженных срезов на· ультрамикротоме с криокамерой

Преимущества криофиксации в более быстром приготовлении образцов, доступности реактивов, экономичности, большей сохранности клеточных структур за счет отсутствия химического воздействия и максимальной доступности антигенов. С другой стороны, возникают проблемы хранения образцов, компрессии срезов и проблемы глубокой заморозки клеток без повреждения. Во избежание разрыва клетки вследствие кристаллизации внутриклеточной жидкости необходимо провести процедуру витрификации. Витрификацией называется процесс, при котором жидкость охлаждается настолько стремительно, что молекулы воды затвердевают без кристаллизации, формируя аморфный (или vitreous) лед (рис. 24). Про такой образец говорят, что он был криоиммобилизован и затвердел в состоянии in vivo. Такая быстрая заморозка возможна лишь в условиях высокого давления. Существуют специальные приборы для заморозки при высоком давлении, которые позволяют в сотые доли секунд заморозить образец на глубину в несколько сотен микрометров без образования кристаллов льда. Наиболее эффективно криофиксация проходит на небольших объектах, поэтому лучше всего она подходит для вирусов, суспензий клеток, небольших фрагментов тканей и очищенных макромолекул.

Заливка в парафин позволяет получать гистологические срезы больших размеров (гистотопографические срезы), например срезы всего органа (матка, почка) или его значительной части (доля легкого). Заливку проводят вручную, и для нее требуется дополнительное время на всех этапах. Для приготовления таких срезов из ткани головного мозга с помощью мозгового ножа де­лают срез свежей ткани толщиной около 1 см и закладывают в ванну с фиксатором. Для того чтобы сохранить плоскую конфи­гурацию среза, его кладут между двумя проволочными сетками, которые притягивают друг к другу резиновыми кольцами. Про­должительность фиксации 48 ч. После промывки в проточной воде (3—4 ч) следует обезвоживание в 70 %, 96 % и 100 % спир­те (по 2 смены) в течение 48 ч. Для обезвоживания можно при­менить изопропиловый спирт, обеспечивая частую его смену и температуру 45 °С (в термостате). Это позволяет избежать по­лучения чрезмерно жестких препаратов. В качестве промежу­точной среды используют метилбензоат или хлороформ — 3 смены по 3 дня. Объекты заливают в парафин или парапласт, имеющие температуру плавления 56—58 °С.

24. 1. Перед окрашиванием образцы освобождают от парафина, проводя по батарее растворителей:

ксилол, спирт 100 %, 96 %, 80 %, 70 %, 60 %, вода (по 2-5 мин)

(Этот ряд кончается водой в том случае, если затем используется водорастворимый краситель.)

2. Для окрашивания предметные стёкла со срезами

помещают на короткое время в раствор красителя,
промывают водой,
обрабатывают раствором другого красителя (если таковой используется тоже) и
вновь промывают водой.

3. Препарат
опять обезвоживают (проводя по батарее спиртов с возрастающей концентрацией),
а затем просветляют (в карбол-ксилоле и ксилоле) - для удаления лишней краски.

4. Наконец, на препарат наносят каплю канадского бальзама (в случае среза) или
кедрового масла (на мазки крови) и накрывают покровным стеклом

Депарафинизация-регидратация

1. Подписать стекла, заклеить надписи скотчем

2. Провести через растворы: Ксилол I, 7’ü Ксилол II, 7’ü 96%-ный спирт, 5’ü 96%-ный спирт, 5’ü dH₂O, ≥3’ü

Дегидратация, заключение срезов

• Проведение окрашенного среза последовательно через спирт и толуол

• Заключение в нейтральную среду под покровное стекло

Среды для заключения • Смолы • Водные среды

Характеристики сред • Коэффициент преломления света • Однородность

• Коэффициент преломления 1.5, Препарат отличается стабильностью при воздействии прямых солнечных лучей, УФ-лучей, высоких температур и влажности.

Чтобы препарат сохранялся в течение достаточно долгого времени, окрашенный срез накрывают покровным стеклом, смазанным каким-нибудь клейким веществом, которое постепенно затвердевает. Для этого используют канадский бальзам (природная смола) и различные синтетические среды. Приготовленные таким образом препараты можно хранить годами. Для изучения тканей в электронном микроскопе, позволяющем выявить ультраструктуру клеток и их компонентов, применяют другие методы фиксации (обычно с использованием осмиевой кислоты и глутаральдегида) и другие среды для заливки (обычно эпоксидные смолы)

 

25. В основе окрашивания клеток и тканей лежат физико-химические процессы (диффузия, адсорбция, абсорбция, растворимость и др.), происходящие как в красителе, так и в микроструктурах. Большое значение имеют плотность ткани и дисперсность красителя, которые определяют последовательность и скорость окрашивания.

Целью окрашивания является более отчетливое выявление различных компонентов клеток и тканей. Некоторые красители обеспечивают этот эффект, растворяясь в выявляемых компонентах, например нейтральных жирах. Другие красители вызывают химическую реакцию, например выявление железа с образованием берлинской лазури в кислой среде. Во многих случаях процесс окрашивания возможен только при наличии протравы, например гематоксилин окрашивает ткань в присутствии солей металлов.

 

Важнейшей является классификация гистологических красителей по химическим свойствам, так как на ней базируется ряд понятий и терминов, которые далее будут встречаться в течение всего курса. Итак, по химическим свойствам гистологические красители разделяют на кислые, основные и нейтральные. Свойства кислых красителей определяются группами, это так называемые анионные красители. Кислые красители окрашивают цитоплазмуклетки, их называют цитоплазматическими. Примером таких красителей могут быть эозин (дает ярко розовый цвет), светлый зеленый (дает зеленый цвет). Гистологические структуры, способны окрашиваться кислыми красителями, называют оксифильные (ацидофильными, эозинофильными). Это, например, цитоплазматические гранулы эозинофильных лейкоцитов, коллагеновые волокна и т.п.

Основные красители являются катионными, подавляющее большинство их в составе молекулы имеет положительно заряженные атомы азота. Указанные красители избирательно окрашивают ядра клеток и поэтому их называют ядерными. Примером могут быть гематоксилин (окрашивает в сине-фиолетовый цвет), кармин (в светло-красный), сафранин (в темно-красный), азур II (в фиолетовый). Гистологические структуры, способны окрашиваться основными красителями, называют базофильными. Это гранулы в цитоплазме базофильных лейкоцитов, ядра клеток и т.п.

Нейтральные красители образуются при сочетании водных растворов кислого и основного красителей, например, еозиново-кислый метиленовый синий. Кроме того, следует различать нейтральные красящие смеси, когда в растворе одновременно присутствуют основной и кислый красители. Структуры, которые одновременно воспринимают как основные, так и кислые красители, называют нейтрофильными или полихроматофильиимы.Примером могут служить гранулы нейтрофильных лейкоцитов, цитоплазма полихроматофильных эритробластов т.п. Способность гистологических структур менять цвет основного красителя обозначается термином метахромазия. Метахроматически окрашивается зернистость базофильных лейкоцитов, межклеточное вещество хрящевой ткани и т.д. Препараты всегда красят сообщением одного кислого и одного основного красителей, что позволяет выявить ядро, цитоплазму и все базофильные и оксифильные структуры. Одним из наиболее часто применяемых сочетаний является гематоксилин–эозин

26. Окрашивание

I. По характеристике процесса: • Прогрессивное • Регрессивное

II. По действию красителя на ткань: • Прямое • Непрямое

ь III. По количеству красителей: • Простое • Сложное 1. Окраска гематоксилин-эозином • Применяется наиболее часто как обзорная окраска тканей (в т.ч. в медицинской диагностике) • Результат: ядра синие или фиолетовые, цитоплазма розовая или оранжевая

Гематоксилины

• По характеру протравы: 1) Квасцовые 2) Железные 3) С солями других металлов (Cu, Cr, Mo, V)

• По составу растворителя: 1) Спиртовые 2) Водные

⇐ Предыдущая3456789101112Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: