Способы мечения антител. Прямой и непрямой методы детекции иммунных комплексов после иммуногистологических реакций.

С помощью изотопной, флюоресцентной или ферментной меток можно значительно повысить чувствительность многих иммунологических методов, кроме того, эта техника способствует совершенствованию методов исследования.

Иммунофлюоресценция служит в первую очередь для качественной оценки иммунологических реакций, локализованных на тканевых срезах или изолированных клетках. Меченые антитела (реже антигены) получают с помощью конъюгации с флюоресцентными красителями. При этом предполагается, что антитела или антигены образуют комплекс с флюоресцентными веществами и одновременно сохраняют способность к иммунному реагированию. В клинической практике нашли применение различные модификации этой техники.

1. Прямой метод Кунса. При этом наиболее простом варианте флюоресцентной техники меченую антисыворотку (или выделенную фракцию антител) добавляют к исследуемому препарату. Происходит реакция антиген-антитело, несвязанные антитела удаляют путем тщательного отмывания. При микроскопическом исследовании в том участке, где локализуется реакция, обнаруживают флюоресценцию. Использование антител к определенным классам Ig превращает этот метод в оптимальный способ для выявления Ig на клеточной мембране.

2. Непрямой метод Веллера и Кунса. Исследование проводят в два этапа. Прежде всего препарат обрабатывают немеченой антисыворткой известной специфичности, а несвязанные антитела удаляют путем тщательного отмывания. На II этапе предварительно обработанный препарат инкубируют с антисывороткой, меченной анти-Ig, и после этого также удаляют несвязанные антитела. В результате антитела с флюоресцентной меткой локализуются исключительно в том участке, где в I фазе произошло связывание антител. Преимущество данного метода состоит в том, что с помощью поливалентного антигена (в этом случае используют немеченую антисыворотку) достигают усиления эффекта. К тому же нет необходимости в наборе меченых сывороток разной специфичности, а применяют лишь одну анти-Ig или моноспецифические сыворотки к определенным классам Ig.

Для более точных выводов необходимы способы контроля, отвечающие следующим требованиям:

- меченая нормальная сыворотка не должна вступать в реакцию;

- преинкубация меченой сыворотки с собственным антигеном препятствует проявлению флюоресценции в тканях;

- тот же самый эффект дает преинкубация срезов тканей с немечеными антителами.

Ложноотрицательные результаты могут иметь место в том случае, если в процессе неосторожного отмывания был нарушен комплекс антиген-антитело.

Возможности использования иммунофлюоресценции многообразны. Наиболее важные из них связаны с вышеуказанными модификациями метода:

- идентификация и локализация гетеро- или аутологичных антигенов (например, бактерий, вирусов, грибов и возбудителей паразитарных инфекций; гетероантигенов при аллергических реакциях; аутоантигенов при аутосенсибилизации) в тканях или на изолированных клетках. Практическое применение метода выходит за рамки иммунологии. С помощью тест-сывороток можно, например, определить локализацию синтеза гормона роста и АКТГ в определенных клетках передней доли гипофиза.

- доказательство выработки антител определенной специфичности при использовании известного антигена, обнаружение антителообразующих клеток.

- доказательство реакции антиген-антитело в тканях с помощью идентификации участвующих в ней антител, антигенов и компонентов комплемента (например, при сывороточной болезни).

В ряде случаев иммунофлюоресценция была использована для количественной оценки результатов. Так как для этой цели ткани оказываются не вполне подходящими, соответствующие антигены адсорбируют на поверхности гомогенных частиц (латекс, сефароза, эритроциты), с помощью меченой сыворотки анти-Ig и флюорометрии проводят количественный анализ антител. Модификацию применяют и при анализе антигенов.

Радиоактивная метка по сравнению с флюоресценцией имеет то преимущество, что еще более повышаются чувствительность метода и точность количественной оценки результатов. Применение радиоизотопной метки возможно при условии, что антитела или антигены, меченные 131I, 125I или 3Н и 14С, сохраняют способность участвовать в иммунологических реакциях.

Визуализация = Детекция

31.Демаскировка

32. Правила получения микрофотографий с гистологических препаратов.

1. Включите компьютер и микроскоп, установите препарат на предметный столик (ВНИМАНИЕ: ставить и убирать предметное стекло только с объективом х10!!!), настройте резкость и установите комфортное для глаз освещение

2. На рабочем столе запустите программу LAS V4.3

3. Убедитесь, что диафрагма камеры установлена в промежуточное положение и изображение подается как в окуляры, так и на камеру

4. В программе на вкладке "Захват - Камера" выберите подраздел "Параметры ввода", в выпадающем списке "Конфигурация" выберите "По умолчанию". Изображение покраснеет.5. На вкладке "DFC450 C - Последнее использование" уберите выделение с левого верхнего значка ("Автоэкспозиция"), нажмите второй слева в верхнему ряду значок ("Автоматический баланс белого для всего изображения",), затем снова значок автоэкспозиции. На изображении автоматически настроится баланс белого и экспозиция.

6. При каждой смене объектива повторяйте только шаг 5.

7. Когда выберет поле зрения для фотографирования, нажмите внизу "Захват изображения", при этом появится диалоговое окно, в котором необходимо выбрать объектив, установленный в данный момент и нажать "Acquire". Не касайтесь микроскопа и стола в момент фотографирования, иначе изображение получится смазанным.

8. Ваше изображение автоматически сохранится в папке "Библиотеки - Изображения - Гистология учебная" (Полный путь C:\Users\Public\Pictures). Не меняйте папку, в которой сохраняются фотографии! Откройте в Проводнике данную папку и переименуйте изображение, указав название препарата, дату, увеличение, свою фамилию. Истинное увеличение получают умножением увеличения окуляров (всегда х10) на увеличение объектива, например если установлен объектив х20, то увеличение 10х20=200.

9. Чтобы продолжить фотографирование, в программе перейдите в папку захват.