Главная | Обратная связь | Поможем написать вашу работу!

Гематоксилин – эозин: протокол

⇐ ПредыдущаяСтр 9 из 23Следующая ⇒

• Депарафинизация-регидатация • Гематоксилин Майера – 1 мин

• Промывка в проточной воде – 5 мин

• Водный эозин – 10 сек.

• Промывка в дистиллированной воде – 5 мин

• Просветление, заключение под покровное стекло

Окраска по Ван Гизону

• Применяется для выявления фиброза

• Гематоксилин Вайгерта → пикриновая кислота + фуксин

• Результат: ядра становятся чёрными или тёмно-бурыми, мышечные и эластические волокна – жёлтыми, коллагеновые – ярко- красными

Окраска по Массону

• Применяется для выявления фиброза

• Гематоксилин Вайгерта → кислый фуксин → фосфорно-молибденовая кислота → анилиновый синий

• Результат: ядра окрашиваются в чёрный цвет, протоплазма клеток – в розовый, фибрин – в красный, коллагеновые и ретикулярные волокна – в синий

Протокол окраски по Массону

• Депарафинизация-регидратация

• Гематоксилин Вайгерта – 5 мин (раствор А + раствор Б 1:1)

• Дифференцировка в 0,5% солянокислом спирте – 5 сек

• Промывка в проточной воде – 10 мин • Кислый фуксин – 5 мин

• Ополоснуть в дистиллированной воде

• 1% фосфорномолибденовая кислота – 15 мин

• Анилиновый синий – 5 мин

• Ополоснуть в водопроводной воде, 1% уксусная кислота – 10 мин. • Просветление, заключение под покровное стекло

5.Окраска по Маллори - гистологическая техника многоцветной окраски срезов, позволяющая выявлять волокнистые структуры соединительной ткани и ряд др. объектов, включает последовательную обработку фуксином, фосфорномолибденовой кислотой и смесью анилинового синего, оранжевого Ж и щавелевой кислотой; метод предложен Ф.Маллори в 1900.

Окраска по Маллори очень популярна в различных лабораториях и руководствах. Так, в зоологии окраска срезов по Маллори дает очень эффектные гистологические картины: ядра красные, мышцы фиолетовые, соединительная ткань голубая. Именно последнее обстоятельство определило применение этой окраски в патоморфологической лаборатории. Здесь окраска по Маллори используется для выявления коллагена. В основе метода лежит уникальное свойство анилинового синего окрашивать коллагеновые волокна, а кислого фуксина — эластические волокна в красный цвет. В результате окраски коллагеновые волокна — темносиние, ядра, эритроциты, эластические волокна — красные, амилоид, гиалин и слизь — голубые, мышечная ткань — оранжевая, нейроглия — краснофиолетовая.

27. ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ — методы изучения химических свойств тканей и выявления особенностей обмена веществ в тканевых структурах.

В основе большинства гистохимических реакций лежат общие принципы.

1. Определенные химические группировки окрашиваются тем или иным красителем. Например, фосфатные группы РНК образуют с основными красителями (пиронин, толуидиновый синий и др.) солеобразные окрашенные соединения

2. Краситель растворяется в определенном субстрате, входящем в состав клеточных структур. Например, окраска жировых включений в клетке основана на растворении Судана в жировой капле.

3. Некоторые химические компоненты клеток, такие, как ДНК, полисахариды, неспособны реагировать с красителями. В таких случаях прибегают к превращению их химических группировок в реакционно-активное состояние (гидролиз ДНК хлористоводородной кислотой, окисление полисахаридов йодной кислотой). При этом освобождаются или создаются вновь химические группировки, которые способны реагировать с соответствующими реактивами, в результате чего образуется окрашенный продукт реакции.

4. При выявлении локализации некоторых компонентов клетки прибегают к многоступенчатым промежуточным реакциям и переводу неокрашенного продукта реакции в окрашенный. Например, так поступают при гистохимическом окрашивании ферментов

Методы исследования химического состава и метаболизма клеток и тканей

Для изучения химического состава биологических структур - локализации веществ, их концентрации и динамики в процессах метаболизма применяют специальные методы исследования.

Цито- и гистохимические методы. Эти методы позволяют выявлять локализацию различных химических веществ в структурах клеток, тканей и органов - ДНК, РНК, белков, углеводов, липидов, аминокислот, минеральных веществ, витаминов, активность ферментов. Эти методы основаны на специфичности реакции между химическим реактивом и субстратом, входящим в состав клеточных и тканевых структур, и окрашивании продуктов химических реакций. Для повышения специфичности реакции часто применяют ферментативный контроль. Например, для выявления в клетках рибонуклеиновой кислоты (РНК) часто используют галлоцианин - краситель с основными свойствами, а наличие РНК подтверждают контрольной обработкой рибонуклеазой, расщепляющей РНК. Галлоцианин окрашивает РНК в сине-фиолетовый цвет. Если срез предварительно обработать рибонуклеазой, а затем окрасить галлоцианином, то отсутствие окрашивания подтверждает наличие в структуре рибонуклеиновой кислоты. Описание многочисленных цито- и гистохимических методов дается в специальных руководствах.

В последние годы сочетание гистохимических методов с методом электронной микроскопии привело к развитию нового перспективного направления - электронной гистохимии. Этот метод позволяет изучать локализацию различных химических веществ не только на клеточном, но и на субклеточном и молекулярном уровнях.

Гистохимические методы • Помогают установить локализацию определенных химических веществ и продуктов их метаболизма в тканях и клетках • Обычно используют криостатные срезы

Гистохимические объекты • Витамины • Липиды • Нуклеиновые кислоты • Углеводы (гликоген) • Белки (амилоид, ферменты)

Гистохимия ферментов

В гистохимической практике ферменты подразделены на 6 главных классов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы (синтетазы). В ходе стандартной гистоферментной реакции срезы ткани помещают в раствор субстрата и специального вещества, способного образовать конечный продукт реакции в виде окрашенного осадка. Следует исключить возможность инактивации фермента и диффузию конечного продукта реакции.

Ферменты–маркёры характерны для некоторых органелл: кислая фосфатаза — лизосомы, сукцинатдегидрогеназа (СДГ) и цитохромоксидаза — митохондрии, глюкозо-6‑фосфатаза — шероховатая эндоплазматическая сеть, Ca²⁺-АТФаза — гладкая эндоплазматическая сеть.

В таблице 1-1 приведена сводка наиболее распространённых методов идентификации разных веществ, а на рисунке 1-3А результаты гистохимического выявления активности АТФазы миозина и сукцинатдегидрогеназы в разных типах скелетных мышечных волокон.

28. Иммуногистохимия -Принцип проведения иммуногистохимической реакции основан на специфическом взаимодействии меченых антител (АТ) с тканевыми антигенами (Аг).