 |
Схема лабораторной диагностики гнойных стафилококковых инфекций
|
|
|
|
| Материал | Метод исследования | Результаты |
| Гной, эксудат, некроти-ческие массы | 1. Микроскопический 2. Бактериологический Посев на ЖСА, МСА А. Микроскопия мазков из колоний Б. Выделение чистой культуры Установление принадлежности культуры к роду Staphylococcus А. Микроскопический Б. Культуральное определение ферментации глюкозы в анаэробных условиях Видовая идентификация I. Коагулаза Определение признаков патогенности 1. Плазмокоагуляция 2. Лецитиназа 3. Гемолизин 4. Гиалуронидаза 5. ДНК-аза | Гр+кокки Рост пигментированных кокков Гр+кокки Гроздекокки Пигментообразование. Ферментация с образо-ванием кислоты Коагулазоположительные |
Идентификация стафилококков
Целью первичной идентификации является установление принадлежности выделенной культуры к семейству Micrococcaceae и роду Staphylococcus. Для установления принадлежности культур к семейству микрококков используют тест на каталазу.
Отмечают способность представителей семейства микрококков, имеющих фермент каталазу, расщеплять перекись водорода, образуя воду и газообразный кислород.
В отличие от микрококков представители родственного семейства стрептококков каталазы не имеют.
Видовая идентификация стафилококков
Последним этапом исследования является дифференциация S. aureus от представителей двух коагулазоотрицательных видов стафилококков. Если установлено, что штамм относится к виду S. aureus, проводят его идентификацию.
Идентификация S. aureus
Ориентировочные данные о принадлежности культуры к Staphylococcus можно получить при изучении характера колоний, выросших после посева исходного материала на элективную среду (для стафилококков – молочно-желточный солевой агар).
|
|
|
Определение лецитоветиллазы (лецитиназы)
Хлористый натрий является элективным фактором, так как подавляет рост большинства представителей микрофлоры, главным образом, грамотрицательной. Из компонентов яичного желтка – лецитоветиллаза является субстратом для фермента лецитоветиллазы. При расщеплении лецитоветиллина вокруг лецитиназоположительной колонии на поверхности среды образуется радужный венчик. Добавление в среду молока путем сложных химических процессов стимулирует образование стафилококками золотистого или лимонно-желтого пигмента, относящегося к группе каротиноидов.
Как правило, штаммы S. aureus обладают лецитиназой и пигментом, а культуры двух других видов лишены их. Возможны, однако, исключения: некоторые штаммы S. aureus не имеют пигмента или лецитиназы, а ряд штаммов S. epidermidis обладают лецитиназной активностью.
Реакция плазмокоагуляции
Принцип. Под действием фермента плазмокоагулазы активизируется естественная система свертывания крови (плазминогенротромбин).
Приготовление свежей плазмы. Стерильно взятую из сердца кровь кролика в количестве 3 мл вносят в пробирку с 2 мл стерильного 5 % раствора лимоннокислого натрия, смешивают и центрифугируют для осаждения форменных элементов крови в течение 10 минут при 1500 об/мин.
Плазму отсасывают, разводят в 5 раз стерильным физиологическим раствором и разливают в стерильные пробирки по 0,5 мл.
Ход исследования. В пробирку вносят 1 петлю суточной агаровой культуры исследуемого штамма, которую суспензируют в плазме. Штатив с пробиркой помещают в термостат при 37 °С и регистрируют результаты через 1, 2, 4 и 18 часов инкубации.
Оценка результатов. Появление на дне пробирки студнеобразного сгустка любого размера считается положительным результатом реакции. Отсутствие свертывания плазмы в течение 18 часов расценивается как отрицательный результат. В качестве контроля рекомендуется ставить реакцию с заведомо коагулирующим и некоагулирующим штаммами, а также оставлять одну пробирку с плазмой незасеянной.
|
|
|
Окончательная идентификация S. aureus требует постановки еще двух тестов. На первом этапе определяют наличие у штаммов плазмокоагулазы. Если после этого штамм идентифицировать не удается, дополнительно определяют один из двух следующих признаков: наличие ДНК-азы (что предпочтительнее) или способность ферментировать маннит в анаэробных условиях.
При наличии положительного результата в реакции плазмокоагуляции и хотя бы в одном из двух предварительных тестов (пигмент лецитиназа) исследуемый штамм может быть отнесен к виду S. aureus (варианты 2-3).
Отсутствие плазмокоагулазы и хотя бы одного из двух первых признаков дает основание считать, что штамм не принадлежит к S. aureus (варианты 5-7).
Расхождения между результатами реакции плазмокоагуляции, с одной стороны, и двух предварительных тестов – с другой (варианты 4 и 8), требует постановки одного из двух дополнительных тестов (ДНК-азы или ферментации маннита в анаэробных условиях). В случае совпадения результатов дополнительного теста с результатами реакции плазмокоагуляции штамм считается либо относящимся к виду S. aureus при положительных результатах (варианты 4а и 4в), либо не относящимся к нему (при отрицательных, варианты 8б и 8г), или отрицательных (принадлежность к другим видам, варианты 4б и 4г) результатов.
Проводить идентификацию S. aureus лишь на основании результата одного теста не рекомендуется.
Определение ДНК-азы
Принцип. Под действием ДНК-азы (дезоксирибонуклеазы) добавленная в плотную среду высокополимерная ДНК распадается на низкополимерные фрагменты. При этом мутная, среда становится прозрачной.
Определение ферментации маннита в анаэробных условиях
Определение ферментации глюкозы в анаэробных условиях. Определение проводят аналогичным путем, в качестве субстрата используют 1% раствор маннита.
Идентификация S. epidermidis и S. saprophyticus
Те штаммы, которые после исследований, описанных выше, признаны не относящимися к S. aureus, подвергаются дальнейшей идентификации для установления их видовой принадлежности.
|
|
|
Дифференциацию S. epidermidis; и S. saprophyticus рекомендуется проводить в трех тестах:
1) определение устойчивости к новобиоцину;
2) наличие фосфатазы;
3) способность окислять маннит.
Для штаммов S. epidermidis характерны: чувствительность к новобиоцину, наличие фосфатазы, неспособность окислять маннит; для штаммов S. saprophyticus – противоположные свойства. Поскольку не все стафилококки по своим характеристикам укладываются в указанную схему, такие штаммы следует обозначать Staphylococcus Spp.
Вопросы для обсуждения
1. Общая характеристика патогенных кокков.
2. Морфология, тинкториальные и культуральные свойства стафилококков.
3. Токсины и ферменты "агрессии".
4. Классификация стафилококков.
5. Способы обнаружения токсинов и ферментов "агрессии".
6. Лабораторная диагностика.
7. Препараты, применяемые для специфического лечения и профилактики стафилококковых заболеваний.
|
|
|
