Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

ПЦР была открыта в 1986 г. американским биохимиком Кэри Мюллисом. Журнал «Science» назвал это открытие самым выдающимся в биологии последних лет, а Мюллис в 1995 г. был награжден Нобелевской премией. ПЦР позволяет выявить в ис­следуемом материале наличие специфического участка ДНК, ха­рактерного для исследуемого организма, и многократно размно­жить его. В основе метода лежит многократное увеличение числа копий специфического участка ДНК (так называемая направ­ленная амплификация ДНК). Этот процесс катализируется фер­ментом ДНК-полимеразой.

Использование термостабильной ДНК-полимеразы, ис­точником которой служат термофильные бактерии, создает возможности для автоматизации синтеза нуклеиновой кисло­ты in vitro. Очень высокий уровень чувствительности (96%), являющийся главным достоинством метода, достигается за счет того, что в результате многократного копирования уро­вень специфической олигонуклеотидной последовательности в реакционной пробе возрастает в 104 - 108 раз. Специфичность метода 100%, преимуществом является также быстрота полу­чения результатов (2-3 часа). Особенно хорошо пользоваться этим методом для выявления микроорганизмов, являющихся облигатными паразитами. К ним, в частности, относятся хламидийные инфекции.

Методом ПЦР предпочтительно выявлять и персистирующие микроорганизмы. В ходе длительного пребывания в мно­гоклеточном организме в персистирующих бактериальных клет­ках активизируются приспособительные механизмы, направ­ленные, прежде всего, на защиту от агрессивного воздействия на них иммунной системы. Результатом действия этих механиз­мов может быть маскировка или видоизменение антигенных детерминант, выявление которых служит основой иммуноло­гических методов микробиологической диагностики. К числу таких возбудителей относятся микоплазмы и уреаплазмы, вы­явление которых методом ПЦР является наиболее точным. Материалом для исследования при использовании ПЦР-анализа служит любая биологическая среда организма: кровь, сы­воротка, мазки, смывы, слюна, мокрота, желудочный сок, биопсийный материал, соскоб из цервикального канала.

Для определения возбудителей в цервикальном канале уретральным концом ложки Фолькмана или специальным зон­дом одноразового использования для взятия биоматериала пос­ле удаления ватным тампоном слизи производят забор материа­ла с поверхностными клетками цервикального канала. Забран­ный материал переносится в микроцентрифужную пробирку типа Эппендорф, в которую предварительно наливается 0,1 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Пробирки и весь инструмент должны быть стерильными. Для исключения контаминации забор материала нужно проводить одноразовыми инструмен­тами, либо, если инструмент многоразовый, его нужно прока­лить на пламени горелки в течение 30—60 с. В замороженном состоянии пробы могут храниться до 2—3 месяцев.

Таким образом, ПЦР-тест является наиболее современным и перспективным в настоящее время.

ЭПИДАНАМНЕЗ

В диагностике инфекционных болезней необходимость детального сбора эпиданамнеза представляет наиболее существенную особенность расспроса больных. Под эпиданамнезом понимают сумму сведений, характеризующих возможный источник инфекции, механизм заражения и пути передачи. В диагностике многих инфекционных бо­лезней характерный эпиданамнез имеет, если не решаю­щее, то, во всяком случае, первостепенное значение. Ди­агностическая информативность эпиданамнеза на сов­ременном этапе особенно очевидна с учетом «обеднения» клинической симптоматики инфекционных болезней. Уточнение эпиданамнеза уже при первичном обращении больного к врачу позволяет сразу же наметить план ор­ганизации необходимых противоэпидемических и профи­лактических мероприятий. Недооценка эпиданамнеза и соответственно позднее начало противоэпидемических мероприятий в значительной мере обусловили дальней­шее расширение получившей широкую известность вспы­шки туляремии в годы ВОВ и наиболее крупной эпиде­мии ГЛПС во время войны в Корее.

Важное значение имеет учет сложившейся эпидситу­ации. В период эпидемических вспышек гриппа, других ОРВИ, острых кишечных инфекций, подъема заболевае­мости детскими капельными инфекциями (скарлатина, ветряная оспа и др.) доля инфекционных болезней в ра­боте участковых врачей становится особенно большой, может достигать 80 – 90% всех больных. В этих усло­виях, как мы могли многократно убедиться, легко воз­никает опасность гипердиагностики инфекционных болез­ней. Причиной служит недопустимая априорная уверен­ность врачей в диагнозе, забвение незыблемого правила о необходимости проведения первичного дифференциаль­ного диагноза практически при любой эпидситуации.

Столь же важен для врачей общей практики учет особенностей инфекционной заболеваемости в том или ином регионе. Распространенность разных инфекционных болезней на разных территориях неравномерна. Это осо­бенно относится к зоонозным инфекциям. Наличие при­родных или антропургических очагов на территории об­ласти определяет преимущественную возможность зара­жения данной инфекцией. При предполагаемом диагно­зе антропонозных инфекций первостепенное значение имеет уточнение контакта с больными, учет нередкого формирования эпидочагов — менингококковой инфекции, дифтерии, вирусных гепатитов и др. Соответствующую информацию о наличии эпидочагов можно получить в территориальных центрах санэпиднадзора.

Для оценки особенностей краевой инфекционной патологии важно сопоставить областные цифры с показате­лями заболеваемости по стране в целом. Индекс заболе­ваемости соответствует числу заболевших на 100 тыс. на­селения. В относительно небольших населенных пунктах, рассчитывают на 10 тыс., а для сравнения интерполиру­ют на 100 тыс.

План сбора эпиданамнеза при разных инфекциях не­однозначен, требует учета принадлежности предполага­емого заболевания к той или иной группе инфекций (ки­шечные, дыхательных путей, кровяные – трансмис­сивные и нетрансмиссивные, наружных покровов; антропонозы и зоонозы), данных профессионального и так на­зываемого географического анамнеза, сезонности, особен­ностей сложившейся эпидситуации. Вполне понятно, что эпиданамнез информативен только в пределах продолжи­тельности инкубационного периода при предполагаемой инфекции. Это требует от врача общей практики зна­ния продолжительности инкубации при всех широко распространенных инфекциях.

Кишечные инфекции. Сбор эпиданамнеза должен учитывать все возможные пути передачи — кон­тактный, алиментарный, водный. При гастроинтестинальных формах сальмонеллеза и дизентерии, ботулизме, большей части эшерихиозов, пищевых токсикоинфекциях разной этиологии, многих гельминтозах заражение про­исходит алиментарным путем. Поэтому сбор эпиданамнеза практически соответствует пищевому анамнезу. Уточняют перечень блюд, употреблявшихся заболевшим в течение предшествовавших суток, их свежесть, сроки приобретения и условия хранения, органолептическую ха­рактеристику. Важна информация о других людях, упот­реблявших эти же продукты, состоянии их здоровья. Ес­ли речь идет о групповом заболевании, необходим об­общенный анализ пищевого анамнеза, позволяющий уточнить так называемый «подозрительный пищевой про­дукт». При этом учитываются возраст заболевших, нали­чие у них хронических заболеваний органов пищеварения, уровень кислотности желудочного сока, определяющих возможную вариабельность порогов развития инфекцион­ного гастроэнтерита. Соответственно, при казалось бы совершенно идентичном пищевом анамнезе нередко заболевают только отдельные лица. Иногда данные пи­щевого анамнеза позволяют предположить определен­ную нозологическую форму. Так, например, для диагно­за ботулизма информативны указания об употреблении продуктов домашнего консервирования (особенно ово­щей, грибов, крупной рыбы), бруцеллеза – сырого овечь­его молока или приготовленного из него сыра-брынзы, весенне-летнего энцефалита – сырого козьего молока, сальмонеллеза – домашних птиц и яиц.

При некоторых кишечных инфекциях, прежде всего холере, основное, практически единственное значение имеет водный путь передачи. Соответственно, при сборе эпиданамнеза уточняются источники водоснабжения, пребывание на реках, особенно в нижнем течении круп­ных рек, расположенных в южных широтах. Водный путь передачи является основным при шигеллезе Флекснера, НАГ-инфекции, лептоспирозе, балантидиазе, некоторых гельминтозах (фасциолез).

При многих фекально-оральных инфекциях ведущим является контактный путь передачи. Примером могут служить брюшной тиф, паратифы. Особенно часто реа­лизуется контактный путь передачи у детей. При пред­полагаемой антропонозной инфекции важно учитывать контакты с больными с практически любой патологией. Задача эта весьма трудна, поскольку источниками ин­фекции могут явиться больные со стертым легчайшим те­чением болезни, с клинически минимальными проявле­ниями.

Существенным источником инфекции являются лица с субклиничеокой формой процесса, так называемые бак­терионосители – практически здоровые лица, которые могут быть выявлены исключительно по данным бакте­риологического контроля. При угрозе формирования эпидочагов скрининг разных групп населения совершенно обязателен в целях выявления и нейтрализации источ­ников инфекции.

Контактный путь передачи является основным и при вирусном гепатите А. В учебной литературе по инфекци­онным болезням, даже последних лет, вся группа вирус­ных гепатитов традиционно рассматривается в разделе кишечных инфекций. Вместе с тем фекально-оральный механизм заражения, кроме гепатита А, присущ толь­ко гепатиту Е. Причем, в отличие от гепатита А, при ге­патите Е основное значение имеют не контактный путь передачи, а водные эпидемические вспышки. Контактный путь передачи является ведущим и при некоторых гель­минтозах, например, энтеробиозе.

Нередко при кишечных инфекциях и инвазиях могут быть реализованы с большей или меньшей частотой раз­ные пути передачи (амебиаз, бруцеллез, ротавирусный гастроэнтерит, аскаридоз и др.).

Инфекции дыхательных путей. Сбор эпид­анамнеза предполагает учет воздушно-капельного меха­низма заражения. Это прежде всего группа наиболее широко распространенных инфекционных болезней – грип­па и других ОРЗ, доля которых достигает 85–90% всей инфекционной заболеваемости. Воздушно-капельный путь передачи является основным и при многих других инфекционных болезнях – менингококковой инфекции, дифтерии, инфекционном мононуклеозе, натуральной ос­пе, легочной форме чумы и др. При инфекциях дыха­тельных путей заражение реализуется при разговоре, чи­хании, кашле, громком крике, наконец, совместном пре­бывании с заболевшим в закрытом, особенно тесном по­мещении. При некоторых зоонозах ведущим является не воздушно-капельный, а воздушно-пылевой путь передачи (орнитоз, геморрагическая лихорадка с почечным синд­ромом (ГЛПС), бруцеллез, туляремия, Ку-лихорадка). Своеобразны пути заражения легионеллезом, связанные с вдыханием водного аэрозоля (в системе кондиционеров, головках душевых установок и др.).

Кровяные трансмиссивные инфекции. Кро­вяным трансмиссивным инфекциям в своем большинстве присуща очаговость распространения, поэтому при сбо­ре эпиданамнеза важно уточнить пребывание в небла­гополучных эндемичных регионах. Это особенно важно для трансмиссивных зоонозов, которым присуща природ­ная очаговость (чума, туляремия, геморрагические ли­хорадки, системный боррелиоз и др.). Лишь при неболь­шой части трансмиссивных инфекций (малярия, сыпной, тиф, флеботомная лихорадка) источником инфекции яв­ляется человек. Однако и при трансмиссивных антропонозах, за небольшим исключением, сохраняется очаго­вость. Некоторые трансмиссивные инфекции стали для России сугубо завозными, например, малярия. При всех инфекциях этой группы важно подтверждение трансмис­сивного пути передачи. Для этого необходимо выяснить наличие педикулеза, уточнить сведения об укусах вшей (втирание в кожу при расчесах) и других кровососущих насекомых (комары, блохи, москиты, клещи). При этом приходится учитывать разную сезонность трансмиссивных инфекций. Так, например, для диагностики весенне-летнего энцефалита указания о снятии клеща особенно тревожны в мае-июне и диагностически менее информа­тивны в зените и конце лета. Важен учет распространен­ности животных, являющихся источниками инфекции. В этом отношении информативны указания об увеличении численности мышевидных грызунов, представляющих по­тенциальную опасность заражения ГЛПС, псевдотубер­кулезом, туляремией. Это относится и к наличию, и к рас­пространенности переносчиков. Появление комаров из рода Anopheles при наличии больных, малярией созда­ет угрозу возникновения эпидемического очага. С дру­гой стороны, отсутствие на территории России перенос­чиков желтой лихорадки (Aedes africanus, Aedes aegypti) определяет возможность исключительно завозного за­болевания.

Для многих инфекций данной группы трансмиссивный механизм заражения не является единственно возмож­ным. В частности, при чуме, наряду с укусами инфици­рованных блох, заражение человека возможно контакт­ным (при разделке шкурок или мяса инфицированных животных), алиментарным (употребление в пищу обсе­мененных микробами продуктов) и аэрогенным путем (от больных легочной формой болезни). Множественные пу­ти передачи (трансмиссивный, контактный, алиментар­ный, воздушно-пылевой) возможны и при туляремии, крысином сыпном тифе, Ку-лихорадке, ГЛПС, Омской геморрагической лихорадке. Алиментарный путь зараже­ния подтвержден и при клещевом весенне-летнем энце­фалите (при употреблении сырого козьего молока).

Кровяные нетрансмиссивные инфекции. При сборе эпиданамнеза следует учитывать группу кровяных инфекций, заражение которыми не связано с кровосо­сущими насекомыми. Эта группа сравнительно немно­гочисленна. В ее состав входят вирусные сывороточные гепатиты человека – В, С, Д и ВИЧ-инфекция. Пути их передачи могут быть разными, естественными и искус­ственными. К естественным относятся перинатальный путь (трансплацентарный и в родах от инфицированной матери), половой (в результате нарушения целостности слизистой и кожи), перкутанный (так называемые перкутанные или чрезкожные контакты). К искусственным, или артифициальным, путям – различные медицинские парентеральные манипуляции (инъекции, внутривенные вливания, оперативные вмешательства, гинекологические, урологические, стоматологические, косметические про­цедуры с использованием инфицированного инструмен­тария, переливание зараженной крови, пересадка орга­нов и др.). С учетом сохраняющегося дефицита разовых шприцев, игл, инструментария, далеко не полного укомп­лектования лечебно-профилактических учреждений цент­рализованными стерилизационными отделениями сохра­няет первостепенное значение так называемый «шприцевой» путь передачи. Подобный механизм заражения реализуется не только при медицинских, но и немедицинских парентеральных манипуляциях (введение нар­котиков, особенно внутривенно, ритуальное кровосме­шение, нанесение татуировки). Благодаря повсеместно­му отбору доноров посттрансфузионный путь передачи при гепатите В, ВИЧ-инфекции в значительной мере блокирован. Сохраняет свою актуальность возможность посттрансфузионного заражения гепатитом С и цитомегаловирусной инфекцией в связи с отсутствием регла­ментированного контроля доноров.

Инфекции наружных покровов. В группе инфекций наружных покровов заражение происходит контактным путем в результате проникновения возбуди­телей через поврежденную кожу или слизистые. Боль­шая часть инфекций данной группы относится к зоонозам. Этим определяется информативность выяснения возможных контактов с сельскохозяйственными животными (крупный рогатый скот при сибирской язве, ящуре; свиньи при эризипелоиде; лошади при сапе). Соот­ветственно, важное значение имеет уточнение профес­сионального анамнеза. Всегда ответственен сбор эпид­анамнеза при подозрении на бешенство. Важно учиты­вать не только укусы, но и факт ослюнения, а также стараться получить возможно полную информацию о поведении и судьбе животного. Заражение столбняком связано с травмами и загрязнением ссадин землей, со­держащей споровые формы возбудителя («болезнь бо­сых ног»). Близкий механизм заражения имеет место при мелиоидозе. Единственный антропоноз среди ин­фекций наружных покровов – рожа. Источником зара­жения являются больные рожей, а равно и другими ви­дами стрептококкозов (ангина, скарлатина, стрептококковая пневмония, стрептодермия), а также носители гноеродного β-гемолитичес-кого стрептококка. Внедре­ние возбудителя через поврежденную кожу и слизистые имеет место и при ВИЧ-инфекции, что позволяет ее так­же отнести к группе инфекций наружных покровов (Е. П. Шувалова, 1990). Однако, как уже было отмече­но, с большим основанием ВИЧ-инфекцию следует рас­сматривать как кровяную нетрансмиссивную инфекцию и половую болезнь. При некоторых инфекциях наружных покровов – ящуре, сибирской язве, сапе – приходится считаться с возможностью заражения и другими путя­ми – алиментарным и аэрогенным.

На основании данных о продолжительности инкуба­ции с учетом ее наибольших величин установлены сро­ки карантина при разных инфекциях. Для особоопасных инфекций (чума, холера, натуральная оспа, желтая ли­хорадка) они утверждены ВОЗ и являются обязатель­ными для всех государств.

Важную дополнительную информацию об источниках инфекции и путях передачи, наряду со сбором эпиданамнеза, дают результаты эпидемиологического расследова­ния. В соответствии с инструктивными материалами на каждого больного с предполагаемым диагнозом инфек­ционного заболевания сразу же оформляется карта экст­ренного извещения, направляемая в территориальные центры санэпиднадзора. Получение такой карты служит основанием для проведения эпидемиологического рас­следования, результаты которого существенно дополня­ют данные эпиданамнеза, позволяют сразу же наме­тить и провести необходимые противоэпидемические ме­роприятия, а также служат для решения задачи нозо­логического диагноза.