 |
ПЦР-скрининг на пародонтопатогены
|
|
|
|
На рисунке 3.3.4 представлен ПЦР-скрининг образцов 4 и 5, полученных из пародонтальных карманов пациентов с ХГП легкой степени тяжести.
Рис. 3.3.4 ДНК-фрагменты после ПЦР и разделения в 1% агарозном геле
1, 9 - P. intermedia в образцах 4, 5;
2, 8 - P. gingivalis в образцах 4, 5;
3, 7 - T. forsythia в образцах 4, 5;
4, 6 - A. actinomycetemcomitans в образцах 4, 5;
5 - ДНК-маркер (100 пн – 3000 пн).
В таблице 3.3.2 представлены результаты ПЦР – скрининга на пародонтопатогены.
Таблица 3.3.2
Выявленные пародонтопатогены у пациентов с ХГП легкой степени тяжести методом ПЦР - диагностики
| Образец | P.gingivalis | T.forsythia | P.intermedia | A.actinomycetemcomitans |
| + | + | - | + | |
| + | + | - | - | |
| + | + | + | +/- | |
| + | + | +/- | + | |
| + | + | + | +/- | |
| + | + | + | +/- | |
| + | + | +/- | +/- |
Из результатов проведенного ПЦР – скрининга (таблица 3.3.2) видно, что пародонтопатогены Porphyromonas gingivalis и Tannerella forsythia быливыделены у всех обследованных пациентов (100%), Actinobacillus actinomycetemcomitans былвыделен в 86 %, а Prevotella intermedia - в 71 %, что также отражено на рисунке 3.3.5.
Рис. 3.3.5 Частота обнаружения основных пародонтопатогенов у обследованных пациентов с ХГП легкой степени тяжести
Идентификация выделенных культур
Идентификацию выделенных культур проводили с помощью масс-спектрометрии с использованием MALDI-TOF Microflex LT (Brucker Daltonics, Германия). Результаты масс-спектрометрии приведены в таблице 3.3.3.
Таблица 3.3.3
Идентификация микроорганизмов с помощью MALDI Bityper
| Идентификационный номер культуры | Название микроорганизма | Вероятность идентификации |
| Не определен | - | |
| Не определен | - | |
| Streptococcus gordonii | Высокая | |
| Streptococcus anginosus | Высокая | |
| Streptococcus pneumonia* | Средняя | |
| Streptococcus sanguinis | Средняя | |
| Streptococcus oralis | Средняя | |
| Streptococcus oralis | Средняя | |
| Streptococcus sanguinis | Средняя | |
| Streptococcus sanguinis | Средняя | |
| Не определен | - | |
| Neisseria perflava | Средняя | |
| Не определен | - | |
| Rothia mucilaginosa | Высокая | |
| Rothia mucilaginosa | Высокая |
*Культуры Streptococcus pneumonia, Streptococcus mitis и Streptococcus oralis имеют очень высокую степень совпадения.
|
|
|
Культуры 221, 441, 4212, 511 были также идентифицированы с помощью метода ПЦР, используя специфические праймеры на Streptococcus sanguinis и Streptococcus gordonii (см. материалы и методы исследования). Рисунок 3.3.6 демонстрирует результаты идентификации.
Рис.3.3.6 ДНК-фрагменты после ПЦР и разделения в 1% агарозном геле
1, 2 – ДНК-фрагмент, соответствующий S.gordonii, культура 221;
3 – ДНК-фрагмент, соответствующий S. gordonii, культура 511;
4 – ДНК-маркер (100-1500 пн);
5 – ДНК-фрагмент, соответствующий S. sanguinis, культура 511;
6– ДНК-фрагмент, соответствующий S. sanguinis, культура 441;
7– ДНК-фрагмент, соответствующий S. sanguinis, культура 4212;
8– ДНК-фрагмент, соответствующий S. sanguinis, культура 221;
Таким образом, анализируя полное совпадение результатов масс-спектрометрии и ПЦР, можно заключить, что культура 221 представляет собой S.gordonii, а культуры 441, 4212 и 511 представляют собой S. sanguinis.
Культуры, которые не удалось идентифицировать с помощью масс-спектрометрии (1211, 1212, 311, 531, и 62) идентифицировали методом секвенирования ДНК, кодирующую 16S рибосомальную РНК.
· Подготовка проб ДНК - фрагментов для секвенирования
ДНК-фрагменты, кодирующие 16S рибосомальную РНК, получали с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы ДНК, выделенную из чистых культур 1211, 1212, 311, 531, и 62. После разделения ДНК-фрагментов в 1,0% агарозном геле полученные фрагменты выделяли из геля с помощью набора " AxyPrep DNA Gel Extraction Kit" (Axygen Scientific, США), согласно прилагаемой инструкции. Рис. 3.3.7 демонстрирует разделение ДНК-фрагментов для культур 1211 и 311.
Рис. 3.3.7 ДНК-фрагменты культур 1211 и 311 после ПЦР с последующим разделением в 1,0% агарозном геле
|
|
|
1-4 – ДНК-фрагмент, соответствующий культуре 1211;
5 – ДНК-маркер (100-1500 пн);
7-10 - ДНК-фрагмент, соответствующий культуре 311.
Контроль выделения ДНК-фрагментов проводили с помощью электрофореза в 1,0% агарозном геле (рис. 3.3.8). Наносили по 3 мкл каждой пробы.
Рис. 3.3.8 ДНК-фрагменты культур 1211 и 311 после выделения и очистки с последующим разделением в 1,0% агарозном геле
1 - ДНК-маркер (100-1500 пн);
2 - ДНК-фрагмент, соответствующий культуре 1211;
3 - ДНК-фрагмент, соответствующий культуре 1211;
4 - ДНК-фрагмент, соответствующий культуре 1211;
5 - ДНК-фрагмент,соответствующий культуре 311;
6 - ДНК-фрагмент, соответствующий культуре 1211.
Концентрацию чистой ДНК в пробах измеряли с помощью флюориметра «Qubit» с использованием набора для измерений «Quant-iTTM dsDNA BR Assay kit, 100 assays *2-1000 ng*».
Результаты измерений:
ü 1211 - 24 мкг/мл;
ü 1212 – 29 мкг/мл;
ü 311 – 29 мкг/мл;
ü 531 – 29 мкг/мл;
ü 62 – 26 мкг/мл.
Секвенирование выполняли сотрудники Ресурсного центра «Развитие молекулярных и клеточных технологий» («РМКТ») на базе СПбГУ.
· Результаты секвенирования
Сравнение сиквенсов выполняли с использованием программы сравнения и базы данных на сайте: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
Результат сравнения сиквенсов для культуры 1211 и Rothia mucilaginosa, штамм TeTT представлен на рис.3.3.9. Начиная с 11 нуклеотида, сравнительный анализ показывает 99% совпадения двух сиквенсов, что позволяет идентифицировать культуру 1211 как Rothia mucilaginosa.
Результаты сравнения сиквенсов для культур 1212, 311, 531 и 62 представлены в приложении 2.
1211 11 TACACATGCAGTCGACGATGAAGCCTAGCTTGCTAGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAG 70
|
|
|
