 |
Реакция преципитации в агаре.
|
|
|
|
Данный вариант реакции преципитации применяется для обнаружения, например, токсина, вырабатываемого возбудителем при росте на агаре. Таким способом мы выявляем токсигенность коринебактерии дифтерии.
Для постановки данной реакции необходимо взять чашку с агаром, положить на ее середину полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой, после чего провести перпендикулярно к полоске посев изучаемой культуры. Необходимо помнить, что на этой же чашке должен присутствовать посев заведомо токсигенной культуры, чтобы иметь положительный контроль.
При росте культуры токсин пропитывает агар, одновременно из фильтровальной бумаги противотоксические антитела пропитывают агар, и на месте их соединения образуется комплекс антиген-антитело, что становится видимым, как «усы» преципитации. Результат реакции представлен на рис. 13.
Рис. 13 Реакция преципитации в агаре.
РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ В ГЕЛЕ.
Этот метод еще имеет название иммунодиффузии в геле. Известны простая иммунодиффузия (по Удену), радиальная иммунодиффузия (по Манчини) и двойная (встречная) радиальная иммунодиффузия (по Оухтерлони).
Методы простой диффузии основаны на способности антигена, внесенного в лунки, диффундировать в гель. При постановке двойной диффузии антитела и антиген вносят в отдельные лунки. Обычно данные методы используют для выявления белковых антигенов в различных жидкостях и тканевых экстрактах.
Схема постановки и результаты реакции представлены на рис.
Диффузионный метод преципитации в геле. Принцип метода: вещества (антиген, антитела), диффундирующие в геле навстречу друг другу, реагируя между собой, образуют преципитат беловатого цвета разной конфигурации. В контроле он не наблюдается.
|
|
|
Ингредиенты и техника постановки реакции:
- Готовят 1 - 1,5 % голодный агар - агар, разливают его в горячем расплавленном виде в любые стеклянные объекты: в чашки, на отмытые фотопластины, на предметные стекла (для микрометода). Дают застыть.
- Под объекты подкладывают бумажные расчерченные ориентиры и специальным пробойником делают на равном расстоянии друг от друга лунки. Дно их заливают 1 каплей жидкого агара для избегания затекания реагентов под агар.
- Вносят в лунки 0,1 - 0,5 мл испытуемого вещества (антигена) и напротив специфические преципитирующие сыворотки с антителами.
Рис.14 Реакция преципитации в геле.
- Выдержать в термостате 18 - 24 часа, накрыв реагенты крышкой или стеклом для предохранения от испарения.
- Учет результатов ведут по появлению линии преципитата между содержимым лунок.
- Метка позволяет дифференцировать родство между антигенами (рис. справа). Концевое слияние полос свидетельствует о полной идентичности антигенов; (а) при стыке полос - неполное родство (б) перекрест - разные антигены, но есть групповые антигены (в).
Капиллярная реакция преципитации подобна первым методам, но ставится в капиллярах из комплекта для определения СРБ (С реактивного белка).
Методика: В отличие от пробирочного метода первым набирают лёгкий по массе АГ, затем сюда же – сыворотку с тяжелым АТ. После этого оба капилляра вертикально фиксируют в пластине.
Учёт результата производят в опытной пробе по кольцу преципитации на границе АГ и АТ.
Рис. 15. Капиллярная реакция преципитации.
ИММУННОЭЛЕКТРОФОРЕЗ.
Метод объединяет реакцию преципитации в геле с электрофорезом. Для этого слой агара наносят на предметное стекло, на его разных краях вырезают две лунки, а в центре – разделяющую канавку. В лунки вносят смесь антигенов и проводят электрофорез в течение 1-2 часов. Различные антигены с разной скоростью перемещаются между катодом и анодом. Затем в канавку вносят преципитирующую сыворотку и через 5-7 суток в геле образуются зоны преципитации. Для лучшей визуализации агар окрашивают красителями (например, амидо черным).
|
|
|
Рис.16. Схема постановки иммуноэлектрофореза.
|
|
|
