 |
Метод радиоиммунного анализа – РИА.
|
|
|
|
В основе метода радиоиммунного анализа (РИА) – маркирование радионуклидом антигена или антител, вступающих в реакцию. Образующиеся иммунные комплексы выделяют из системы и определяют их радиоактивность на счетчиках импульсов. Наибольшее распространение получил радиоиммунный анализ на твердой фазе (твердофазный РИА) с использованием меченных антигена или антител, сорбированных в лунках полистироловых панелей. РИА применяют для выявления микробных антигенов, различных гормонов, ферментов и т.д. Широкое распространение метода ограничивает необходимость создания условий, обеспечивающих безопасность работы с радионуклидами.
Рис.19. Схема постановки радиоиммунного метода.
Этапы постановки реакции
1. Стандартное количество антигена, идентичного меченому радиоактивной меткой (например, I123, I131, либо другими изотопами), наливают в пробирку.
2. Добавляют стандартное количество иммунной сыворотки, специфичной антигену. 70- 80% меченого антигена связывается при этом с антителами, образуя радиоактивный преципитат.
3. Добавляют субстрат, исследуемый на присутствие предполагаемого антигена. Если в субстрате есть антиген, идентичный меченому, то он конкурирует с ним, отнимая антитела. Радиоактивность преципитата при этом снижается.
Чем больше в субстрате антигена, тем меньше радиоактивность преципитата.
МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА – ИФА.
Метод иммуноферментного анализа - ИФА – во многом напоминает РИА, но включает использование коммерческих реагентов – антигенов или антител, маркированных ферментами (например, пероксидазой или щелочной фосфатазой). Метод выполняется в полистироловых планшетах, где в лунках фиксирован антиген или антитело. После образования иммунного комплекса в систему вносят субстрат, расщепляемый ферментом, что приводит к окрашиванию среды. В отличие от классических методов выявления, ИФА позволяет непосредственно регистрировать взаимодействие антигена с антителом в специфической фазе, а не анализировать вторичные проявления взаимодействия – агглютинацию, преципитацию или гемолиз. Метод отличает высокая чувствительность – обычно достаточно присутствия антигена в концентрации 1 нг мл.
|
|
|
Рис. 20. Схема постановки ИФА.
Этапы выполнения реакции (на примере диагностики антител при ВИЧ-инфекции):
· В лунки полистиролового планшета, на которых сорбирован антиген ВИЧ, вносят сыворотку крови пациентов. Первая лунка предназначена для внесения заведомо положительной сыворотки, вторая – заведомо отрицательной
· Инкубируем планшет во влажной камере в течение 30 минут
· Промываем лунки планшета фосфатно-солевым буфером 5 раз
· Вносим во все лунки антисыворотку, содержащую антитела против иммуноглобулинов человека, меченные ферментом
· Промываем лунки фосфатно-солевым буфером 5 раз
· Во все лунки добавляем субстрат, содержащий перекись водорода и бензидин
· Выдерживаем планшет 20 минут в темном месте
Проводим визуальный учет результатов и определение оптической плотности раствора в каждой лунке с использованием прибора
При правильной постановке анализа в лунке, содержащей положительную контрольную сыворотку, меняется цвет - он становится желтым. В отрицательном контроле цвет прозрачный. Учет результатов опытных образцов зависит от изменения цвета в исследуемой лунке – если он меняется, как в положительном контроле, значит, у данного пациента обнаружены антитела к ВИЧ.
ИММУНОБЛОТТИНГ.
Иммуноблоттинг – метод идентификации антигена или антител с помощью известных сывороток (или АГ). На практике применяют для идентификации Аг ВИЧ. Первоначально электрофорезом в полиакриловом геле выделяют Аг вируса (на практике используют коммерческий реагент). Затем на полосы преципитата накладывают носитель (нитроцеллюлезную пленку или активированную бумагу) и продолжают электрофорез. После чего на пленку наносят сыворотку пациента и инкубируют. После отмывания несвязавшихся антител (при их наличии) проводят ИФА – на пленку наносят антисыворотку к иммуноглобулинам человека, меченную ферментом, и хромогенный субстрат, изменяющий окраску при взаимодействии с ферментом. При наличии комплексов Аг-Ат-антисыворотка к иммуноглобулинам на носителе появляются окрашенные пятна.
|
|
|
Рис. 21. Схема постановки иммуноблоттинга.
|
|
|
