 |
Минеральные. Ферменты бактерий и их выявление
|
|
|
|
РНК
ДНК
Минеральные
70%
вещество 30%
52%
17%
9% 16%
вещества 3%
|
Из числа химических элементов в составе микроорганизмов имеются (по отношению к сухому веществу): азот – 8 - 15%, углерод – 45 - 55%, кислород – 25 - 30%, водород – 6 – 8%, минеральные вещества – 2 - 15% (рисунок 2).
Рисунок 2 – Химические элементы микробной клетки.
Азот, углерод, кислород и водород принято называть органогенами, так как в основном из них состоят органические вещества.
К минеральным веществам относятся макроэлементы (сера, фосфор, калий, кальций, магний, железо, кремний, хлор) и микроэлементы (марганец, молибден, кобальт, цинк, медь, никель, ванадий, бор). Фосфор входит в состав нуклеиновых кислот, липидов, фосфолипидов. Сера содержится в составе некоторых аминокислот (цистина, цистеина). Магний обеспечивает активность ряда ферментов, например, протеазы. Железо является необходимым элементом для осуществления процессов дыхания и энергетического обмена. Химические элементы образуют в микробных клетках различные органические вещества: белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, витамины и др.
Белки представлены простыми белками - протеинами и сложными белками
– протеидами. Простые белки состоят из аминокислот, а сложные белки, кроме протеина, содержат еще небелковую простетическую группу. Простетическая группа может быть представлена жироподобными веществами — липоидами (липопротеиды), нуклеиновыми кислотами (нуклеопротеиды).
Функции белков:
- структурная (определяют структуру клетки);
- каталитическая (часть белков являются ферментами);
|
|
|
- двигательная (белок флагеллин – белок жгутиков);
- транспортная (белки - переносчики);
- защитная (белки, входящие в состав клеточной стенки);
- резервная (белки, находящиеся в составе запасных веществ).
Углеводы (в основном, полисахариды) выполняют энергетическую роль в бактериальной клетке. Углеводы представлены многоатомными спиртами (сорбит, маннит, дульцит); полисахаридами (гликоген, декстрин, целлюлоза), моносахари- дами (глюкоза и др. ).
Липиды - истинные жиры, липоиды - жироподобные вещества. Одни бактерии содержат небольшое количество липидов (3-7%), другие бактерии содержат значительное количество липидов (до 40%). Бактериальные липиды состоят из свободных жирных кислот, нейтральных жиров, восков, фосфолипидов.
Высокое содержание липидов обусловливает устойчивость некоторых бактерий (например, микобактерий туберкулеза) к спиртам, щелочам, кислотам.
Нуклеиновые кислоты бактерий представлены РНК и ДНК. РНК в основном содержится в рибосомах, ДНК - в нуклеоиде. ДНК является носителем наследственной информации бактерий. Нуклеоид бактерий содержит около 1 тысячи генов. Почти все они кодируют синтез ферментов. Для каждого вида бактерий характерен свой набор ферментов.
Ферменты бактерий и их выявление
Все обменные процессы в бактериальной клетке идут с участием ферментов (энзимов). Ферменты выполняют функцию биокатализаторов. Они представляют собой простые или сложные белки. Принято различать экзоферменты и эндоферменты. Экзоферменты выделяются микробной клеткой во внешнюю среду. Часть экзоферментов связана с питанием бактерий, так как они расщепляют пита- тельные вещества до такой формы, которая способна усваиваться микробной клеткой. Эндоферменты участвуют в разложении питательных веществ внутри клетки и в превращении их в составные части клетки (рисунок 3).
|
|
|
 |
Рисунок 3 – Действие экзо- и эндоферментов бактерий.
Одни ферменты синтезируются бактериальной клеткой постоянно ( конститутивные ферменты ), другие ферменты синтезируются только при контакте с определенным субстратом ( индуцибельные ферменты ). В частности, конститутивными ферментами являются ферменты гликолиза – ферменты окисления глюкозы (гексокиназа, глюкозоизомераза, альдолаза и др. ). Индуцибельными ферментами являются бета-галактозидаза (катализирует расщепление лактозы на глюкозу и галактозу) и бета-лактамаза (расщепляет бета-лактамные антибиотики).
Все ферменты подразделяются на шесть классов:
- оксидоредуктазы;
- трансферазы;
- гидролазы;
- лиазы;
- изомеразы;
- лигазы (синтетазы).
Оксидоредуктазы – это ферменты, которые катализируют окислительно- восстановительные реакции и встречаются во всех живых клетках. Их основная функция – обеспечение организма энергией в доступной для использования форме. Важнейшими представителями оксидоредуктаз являются дегидрогеназы, оксидазы, пероксидазы, гидроксилазы, оксигеназы, каталаза. При идентификации бактерий в основном используют методы выявления каталазы и цитохромоксидазы.
Каталаза разлагает пероксид водорода на воду и молекулярный кислород. Этот фермент выявляют по образованию пузырьков кислорода после смешивания микробной суспензии с 1% раствором перекиси водорода на стекле или после нанесения раствора перекиси водорода на культуру, выросшую на поверхности плотной питательной среды (рисунок 4).
 |  | ||
а б
Рисунок 4 – Выявление бактериальной каталазы на предметном стекле (а) и на поверхности плотной питательной среды (б).
Цитохромоксидаза окисляет молекулы цитохрома С, восстанавливая кислород. Цитохромоксидазу обнаруживают смачиванием бумажки специальным реактивом (1% спиртовый раствор α -нафтола; 1% водный раствор N-диметил-β - фенилендиамина дигидрохлорида). Нанесение на бумажку капли суточной культуры бактерий приводит к появлению синего окрашивания. Для этих же целей выпускают также специальные слайды (рисунок 5).
 |
Рисунок 5 – Тест на цитохромоксидазу.
|
|
|
Трансферазы – ферменты, которые катализируют перенос отдельных радикалов (РО3, Н2, СН3), частей молекул или целых атомных группировок от одних соединений к другим. К трансферазам относятся ацетилтрансфераза, фосфотрансфераза, аминотрансфераза, метилтрансфераза. Эти ферменты в повседневной лабораторной практике не определяют.
Гидролазы – ферменты, которые катализируют реакции расщепления и синтеза белков, жиров и углеводов с участием воды. К этому классу ферментов относятся пептидогидролазы или протеазы - ферменты, расщепляющие белки; гидролазы гликозидов или гликозидазы, расщепляющие гликозиды (β - фруктофуранозидаза, α -глюкозидаза, β -галактозидаза); эстеразы, катализирующие расщепление сложных эфиров (липаза, фосфатаза). При идентификации бактерий в первую очередь изучают ферменты, расщепляющие углеводы и белки. Способность бактерий расщеплять углеводы, называется сахаролитической активностью, а способность расщеплять белки – протеолитической активностью. Эти признаки выявляются по конечным продуктам расщепления субстратов после посева изучаемой культуры на специальные питательные среды. При ферментации сахаров выявляют образование кислоты (молочной, уксусной, муравьиной) или кислоты и газа (углекислого газа, водорода), а при распаде белков – образование щелочей, сероводорода, индола, аммиака.
Для выявления гликозидаз используют жидкие или полужидкие среды Гисса. Жидкие среды Гисса представляют собой пептонную воду, содержащую один из углеводов (лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу и т. д. ) и индикатор Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью). Для улавливания образующихся газов в пробирку помещают поплавок (микропробирку вверх дном), который при стерилизации заполняется средой. Исходный цвет среды – соломенно- желтый. При расщеплении углевода до кислоты наблюдается только изменение цвета среды на красный, а при образовании еще и газа последний скапливается в поплавке. Если углевод не расщепляется, цвет среды не изменяется (рисунок 6).
|
|
|
 |
а б в
| |
Полужидкие среды Гисса содержат 0, 2-0, 5% МПА, 1% одного из углеводов и индикатор ВР (вводно-голубая краска и розоловая кислота). Исходный цвет среды – розово-серый. При расщеплении углевода цвет среды становится голубым, а при образовании газа отмечаются разрывы среды или пузырьки газа (рисунок 7).
 |
а б в
Рисунок 7 - Полужидкая среда Гисса: а – исходная среда: б – разложение углевода до кислоты: в – разложение углевода до кислоты и газа.
Каждый вид бактерий ферментирует только определенный спектр углеводов, поэтому в одних пробирках цвет среды меняется, а в других – остается исходным, в результате чего наблюдается “пестрый ряд”. Иными словами, для каждого вида бактерий характерен свой “пестрый ряд”. Это позволяет отличить один вид бактерий от другого.
Протеазы бактерий выявляют при посеве чистой культуры на специальные питательные среды (мясо-пептонный желатин - МПЖ, молочный агар, мясо- пептонный бульон – МПБ). Результат оценивают по разжижению желатина, разложению казеина молока вокруг колоний или по конечным продуктам распада белков.
Разные виды бактерий имеют разную форму разжижения желатина: золотистый стафилококк – в виде воронки, холерный вибрион – в виде гвоздя (рисунок 8).
 |
Рисунок 8 – Характер разжижения желатина.
Протеолиз казеина проявляется образованием зон просветления вокруг
колоний (рисунок 9).
 |
Рисунок 9 – Протеолиз казеина.
Конечными продуктами распада белков могут быть индол, сероводород и аммиак. Для обнаружения этих продуктов используют индикаторные бумажки, которые помещают внутрь пробирки между стенкой пробирки и ватно-марлевой пробкой. Индикатором на индол (продукт разложения триптофана) является щавелевая кислота. Пропитанная щавелевой кислотой бумажка при наличии индола меняет белый цвет на розовый. В настоящее время тестирование культур на образование индола проводят при помощи реактива Ковача или реактива Эрлиха (рисунок 10).
 |  | ||
а б
Рисунок 10 – Тест на индол с помощью индикаторных полосок (а) и при помощи реактива Ковача (б).
Индикатором на сероводород (продукт разложения серосодержащих аминокислот – цистина, цистеина, метионина) является ацетат свинца. При наличии сероводорода белая бумажка приобретает черный цвет за счет образования сульфита свинца (рисунок 11).
|
|
|
а б
Рисунок 11 – Тест на сероводород: а – положительный тест; б – контроль.
Выявление сероводорода у представителей семейства энтеробактерий проводят на дифференциально-диагностических средах Клиглера или Олькеницкого. Положительный результат проявляется образованием преципитата черного цвета в результате восстановления сульфатов в сульфиты (рисунок 12).
 |  | ||
а б
Рисунок 12 – Рост энтеробактерий на средах Клиглера (а) и Олькеницкого (б).
Черный цвет среды указывает на образование сероводорода.
Индикатором на аммиак (продукт разложения фенилаланина) является лакмусовая полоска бумаги. При наличии аммиака красная лакмусовая бумажка приобретает синий цвет.
Лиазы – это ферменты, которые катализируют отщепление от субстратов определенных химических групп с образованием двойных связей или присоединение отдельных групп (например, аминогрупп, альдегидных групп) по месту двойных связей без участия воды (декарбоксилазы, дезаминазы). В частности, выявление декарбоксилаз проводится на питательных средах с добавлением соответствующей аминокислоты (например, лизиндекарбоксилазу определяют на среде с лизином).
Изомеразы – это ферменты, производящие глубокие внутримолекулярные перестройки, то есть превращение органических соединений в их изомеры (изомеразы, трансферазы, топоизомеразы). В лабораторной практике эти ферменты не выявляют.
Лигазы (синтетазы) – это ферменты, которые катализируют синтез сложных органических веществ (сшивание, лигирование) из простых соединений с одновременным разрывом фосфатных связей (аспарагинсинтетаза, кокарбоксилазы).
У патогенных бактерий часть экзоферментов называется ферментами агрессии. Эти экзоферменты способствуют проникновению и распространению
бактерий в тканях макроорганизма, а также ослабляют его защитные силы. К ферментам агрессии относятся гиалуронидаза, коллагеназа, лецитиназа, ДНКаза, лейкоцидин, гемолизин, плазмокоагулаза, фибринолизин, нейраминидаза, протеаза и др.
В лабораторных условиях определяют такие ферменты патогенности бактерий как гемолизин, лецитиназу, ДНКазу, плазмокоагулазу и фибринолизин.
Гемолизин вызывает гемолиз эритроцитов. Присутствие гемолизина можно установить на кровяном агаре по образованию зоны просветления (зоны гемолиза) вокруг колоний (рисунок 13).
 |
Рисунок 13 – Гемолиз эритроцитов на кровяном агаре.
Лецитиназа расщепляет лецитины на фосфохолины и нерастворимые в воде диглицериды. На желточном агаре действие этого фермента проявляется в виде опалесцирующей зоны (радужного венчика) вокруг колоний (рисунок 14).
 |
Рисунок 14 – Выявление лецитиназы на желточном агаре.
ДНКаза катализирует гидролитическое расщепление полинуклеотидной цепи ДНК с образованием отдельных нуклеотидов и олигонуклеотидов. Для выявления ДНК-азы используют агар, содержащий водный раствор ДНК и раствор кальция хлорида. После выращивания культуры на чашки наносят раствор соляной кислоты. Положительная реакция проявляется прозрачной зоной деполимеризованной ДНК вокруг колоний на мутном фоне, образованном в результате взаимодействия ДНК с соляной кислотой (рисунок 15).
а б
Рисунок 15 – Выявление ДНКазы стафилококков: а – положительная реакция, б – отрицательная реакция..
Плазмокоагулаза вызывает коагуляцию плазмы крови (образование сгустка). Фибринолизин лизирует фибриновые сгустки. Присутствие плазмокоагулазы и фибринолизина определяется с помощью одного теста. В пробирку с плазмой вносят исследуемую культуру. При наличии плазмокоагулазы через 3-4 часа при комнатной температуре образуется сгусток. При дальнейшем культивировании при температуре 36ОС в случае синтеза фибринолизина сгусток разжижается (рисунок 16).
 |
Рисунок 16 – Коагуляция плазмы крови (верхняя пробирка) и разжижение сгустка (нижняя пробирка).
Такие ферменты патогенности как нейраминидаза, гиалуронидаза, коллагеназа в лабораторных условиях в повседневной практике не определяются.
|
|
|
