 |
2.2.3 Выделение РНК. 2.2.3.1 Протокол выделения суммарной РНК. 2.2.4 Синтез кДНК. 2.2.4.1 Протокол обратной транскрипции (синтеза первой цепи кДНК)
|
|
|
|
2. 2. 3 Выделение РНК
Кровь собирали в пластиковые пробирки с антикоагулянтом 0, 1 М раствора EDTA-К3 (pH 7, 3) в соотношении кровь/антикоагулянт 1/100. Забор крови проводили также в виварии КГМУ. В латеральную хвостовую вену или в вентральную/дорсальную артерию устанавливались иглы шприца, для забора крови. Для улучшения кровообращения и быстрому выделения образцов крови хвост прогревался в теплой воде.
Образцы крови выделялись для определения изменения экспрессии генов серотониновой системы, и для анализа уровня гормона стресса (кортизола). ExtractRNA - монофазный водный раствор фенола и гуанидин-изотиоцианата, предназначенный для быстрого выделения суммарной РНК высокого качества.
Добавленный к образцу реагент моментально лизирует клетки, при этом целостность РНК сохраняется за счет высокоэффективного ингибирования активности РНКаз. В процессе денатурации все клеточные компоненты переходят в гомогенат, а затем, после добавления хлороформа и последующего центрифугирования, эмульсия разделяется на водную фазу, интерфазу и органическую фазу, при этом РНК, ДНК и белки оказываются в разных фазах.
Суммарная РНК, выделенная с помощью реагента ExtractRNA была использована для синтеза кДНК.
2. 2. 3. 1 Протокол выделения суммарной РНК
Гомогенизация пробы: гомогенизировали образец в растворе ExtractRNA, инкубировали лизат при комнатной температуре в течение 10-15 мин, чтобы произошла полная диссоциация нуклеопротеидных комплексов, далее центрифугировали лизат при 12 000-15 000 g в течение 10 минут для удаления нерастворенных фрагментов. Супернатант перелили в новую пробирку.
Разделение фаз: Добавили 0. 2 мл хлороформа на каждый 1 мл реагента ExtractRNA, добавленного на этапе гомогенизации. Закрыли пробирку, активно перемешивая содержимое пробирки с помощью встряхивания (вручную) в течение 15 секунд. Инкубирова смесь в течение 3-5 минут при комнатной температуре, периодически встряхивая образец. Центрифугировали образец при 12 000 g в течение 15 минут при 4°C. В ходе центрифугирования произошло разделение смеси на три фазы. РНК находится в водной фазе (верхняя), составляющей 45-50% от общего объема смеси. Держа пробирку наклонно (под углом 45°), аккуратно отобрали водную фазу. Переместили водную фазу в новую пробирку.
|
|
|
Выделение РНК: Добавили в водную фазу 0. 5 мл 100% изопропанола на каждый 1 мл реагента, использованного для гомогенизации. Инкубировали смесь при комнатной температуре в течение 10 мин. Центрифугировали образцы при 12 000 об. в течение 10 мин при комнатной температуре. Тщательно отобрали супернатант, оставив осадок РНК на дне пробирки. Аккуратно, по стенке пробирки, добавили 2 мл 75% этанола на каждый 1 мл изопропанола. Образцы центрифугировали на максимальной скорости в течение 5 мин при комнатной температуре. Удалили этанол. Высушили осадок на воздухе в пробирке с открытой крышкой в течении 5-7 мин. Растворите РНК в необходимом объеме свободной от РНКаз воды. Перемешали раствор пипетированием для лучшего расторения осадка. Встряхивали раствор на вортексе, сбросив капли центрифугированием. Заморозили образец.
2. 2. 4 Синтез кДНК
Для синтеза кДНК использовали вырожденные праймеры с использованием MMLV RT kit (Евроген, Россия).
Набор реактивов предназначен для синтеза первой цепи кДНК на РНК-матрице. Набор содержит обратную транскриптазу вируса лейкемии мышей (MMLV ревертаза). Фермент получен из рекомбинантного штамма Е. coli, экспрессирующего ген MMLV ревертазы дикого типа.
Свойства MMLV ревертазы: осуществляет синтез комплементарной цепи ДНК на РНК-матрице (РНК зависимая ДНК полимераза); обладает слабой активностью РНКазы H; позволяет синтезировать фрагменты кДНК длиной до 5 т. п. о.; обеспечивает высокий выход кДНК: при использовании 100 ед. фермента на 1 мкг РНК выход реакции составляет не менее 100 нг первой цепи кДНК.
|
|
|
2. 2. 4. 1 Протокол обратной транскрипции (синтеза первой цепи кДНК)
Приготовили смесь из компонентов, приведённых в таблице 2, в стерильной пробирке:
Таблица 2- Состав смеси для синтеза кДНК
| Х мкл | Вода для ПЦР |
| 1–6 мкл | РНК матрица (0. 5–2 мкг) |
| 1–3 мкл | Праймер (20 мкМ) |
| 9 мкл | Суммарный объем первой части реакционной смеси. |
Выбрали необходимый праймер. Аккуратно перемешали смесь, сбросив капли со стенок на микроцентрифуге. Прогрели смесь 2 мин при 70 °C для расплавления вторичных структур РНК и перенесли образцы в лед. Сбросили капли реакционной смеси со стенок пробирки на микроцентрифуге. Добавили 11 мкл предварительно подготовленной смеси, состав которой приведён в таблице 3.
Таблица 3- Состав реакционной смеси, добавленного в пробирку с РНК матрицей
| Х мкл | Вода для ПЦР |
| 4 мкл | 5х буфер для синтеза первой цепи |
| 2 мкл | Смесь dNTP (10 мМ каждого) |
| 2 мкл | DTT (20 мМ) |
| 1–3 мкл | MMLV ревертаза (добавили в последнюю очередь) |
| 11 мкл | Суммарный объем второй части реакционной смеси |
Для предотвращения возможной деградации проб добавили в реакцию ингибитор РНКаз. Аккуратно перемешали смесь, сбросив капли со стенок на микроцентрифуге. Инкубировали реакционную смесь 30–60 мин при 37–42 °C. Реакцию проводили в сухом термостате. Для этого наслоили поверх реакционной смеси 1 каплю (15–20 мкл) минерального масла, чтобы объем реакции не изменился из-за испарения. Для остановки реакции прогрели смесь при 70 °C в течение 10 мин.
|
|
|
