Приготовление культур перитонеальных макрофагов мышей

Культуры макрофагов готовят за 1-2 дня до слияния. Макрофаги служат в качестве фидеров, т.е. подкармливающих клеток, устраняют токсичность среды, очищают культуры от клеточного детрита и обеспечивают обогащение среды ростовыми факторами, что создает наиболее благоприятные условия для роста молодых культур гибридом, образующихся после процедуры гибридизации. Макрофаги используют также в пластиках для клонирования с теми же целями.

Методика. Здоровых аутбредных (беспородных) мышей обескровливают декапитацией, поверхность тела мышей обрабатывают 70%-ным этанолом. Внутрибрюшинно каждой мыши вводят 10 мл охлажденной до +4 °C ДМЕМ без сыворотки. Стенки брюшной полости тщательно массируют. Через 5–10 мин мышей фиксируют, вновь обрабатывают 70%-ным этанолом. Брюшную стенку прокалывают стерильной инъекционной иглой и с помощью стерильного шприца аспирируют как можно больше жидкости из брюшной полости. Жидкость переносят в стерильные пенициллиновые флаконы по 10 мл, осторожно подслаивают около 1 мл ФСТ и центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Надосадок отбрасывают. Осадок клеток растворяют в гибридомной среде до концентрации 50 000 клеток на миллилитр и распределяют по 50 мкл в лунки 96-луночных культуральных пластин. Макрофагов, полученных от одной мыши, обычно достаточно на 5–10 пластин.

Культуры инкубируютпри 37 °Cв атмосфере влажного воздуха с 5–6 % СО₂. Через 2–3 часа наблюдается прикрепление макрофагов к полистиролу иих трансформация.

Перед выполнением гибридизации культуры макрофагов тщательно проверяют микроскопически на отсутствие контаминации. Пластины с проростом выбрасывают.

Процедура гибридизации

• За сутки перед слиянием активно растущую культуру миеломы субкультивируют (1/2 часть суспензии клеток.) в свежей гибридомной среде с 20 % ФСТ, но без 8-азагуанина. При этом через 24 часа культура будет находиться в логарифмической фазе роста. На каждую мышиную селезенку необходимо около 20 млн клеток миеломы (в пределах 50 мл культуры).

• В день слияния проверяют культуры мышиных перитонеальных макрофагов на контаминацию.

• Все необходимые среды и 0,83%-ный хлорид аммония помещают в водяной термостат (37 °C). 2 г ПЭГ-4000 растворяют в 3 мл ДМЕМ без сыворотки, нагретой до 37 °C, добавляют несколько капель 2,5%-ного раствора бикарбоната натрия для достижения уровня pH, близкого к 8, и 2-3 капли ДМСО.

• Иммунную мышь с наивысшим титром антител обескровливают декапитацией. Кровь тщательно собирают в стерильный флакон для последующего серологического исследования. Мышь фиксируют в спинном положении. При помощи стерильных инструментов вскрывают брюшную полость, захватывают селезенку, отрезают ее от сальника и переносят в чашку Петри с 1,5–2,0 мл ДМЕМ без сыворотки.

• Ополаскивают селезенку в. среде. Переносят в стерильный гомогенизатор и наливают в него 10–15 мл холодной ДМЕМ без сыворотки, затем осторожно выдавливают пульпу селезенки. Клеточную суспензию переносят в центрифужный стакан, дают суспензии отстояться в течение 5 мин. За это время крупные конгломераты клеток осядут. После этого стерильной пипеткой тщательно собирают надосадок, переносят его в другую пробирку, в которой будет проводиться слияние клеток.

• Стерильной пастеровской пипеткой осторожно подслаивают ГАТ на дно пробирки под суспензию селезеночных клеток. Завинчивают крышку и центрифугируют пробирку в течение 10 мин при 1000 об/мин. Живые клетки пройдут через сыворотку и сформируют осадок. Клеточный детрит останется в интерфазе между средой и сывороткой. Надосадок отбрасывают, а осадок ресуспендируют в 5 мл 0,83%-ного раствора хлорида аммония, нагретого до 37 °C. Происходит лизис эритроцитов. Через 1–2 мин. добавляют 10–15 мл ДМЕМ с 10 % ФСТ, доливают 2 мл сыворотки и вновь центрифугируют.

• Берут 3-4 матраса с активно растущими клетками миеломы. Энергичными движениями отделяют прикрепившиеся клетки и их суспензию переносят в стерильную центрифужную пробирку с закручивающейся крышкой. Клетки центрифугируют в течение 6–10 мин при 1000 об/мин.

• После того как клетки отцентрифугируются, надосадок отбрасывают. Сравнивают объем осадков миеломных и селезеночных клеток. На 1 клетку миеломы должно приходиться не более 10 спленоцитов.

• Ресуспендируют оба осадка в 5 мл бессывороточной ДМЕМ. Затем каждую суспензию сливают в соответствующих пропорциях в центрифужную пробирку. Смесь разбавляют бессывороточной ДМЕМ до 50 мл и центрифугируют в течение 6–10 мин при 1000 об/мин.

• Осадок клеток осушают, удаляя при помощи пипетки всю надосадочную жидкость. Постучав по дну пробирки, разбивают осадок, добавляют в пробирку 1 мл стерильного 40%-ного раствора ПЭГ-4000, нагретого до 37 °C, и тщательно суспендируют в нем клетки. Через 60 с добавляют по каплям безсывороточной ДМЕМ, затем через 60 с еще 4 мл среды, перемешивая содержимое покачиванием пробирки. Выждав еще 60 с, впрыскивают в пробирку струей 8 мл теплой ДМЕМ.

• Через 30 мин клетки центрифугируют, надосадок отбрасывают. Осадок клеток растворяют в теплой гибридомной среде с 20 % ФСТ (или ГС) до конечного объема 50–100 мл и концентрации селезеночных клеток 10 на мл. Конечную суспензию распределяют по 100 мкл в 96-луночные планшеты с 1–2-дневными культурами мышиных перитонеальных макрофагов. Планшеты инкубируют в СО₂-инкубаторе при 37 °С и 5 % СО₂.

• На следующий день добавляют в каждую лунку по 100 мкл ГС с 2-кратной концентрацией ГAT. Проверяют планшеты на контаминацию. В первые 2 недели культивирования используют ГАТ-среду, затем 1–2 недели используют среду ГТ и в последующем — ГС с 20–15 % ФСТ. Сменять необходимо только половину среды, так как 100%-ная свежая среда губительна для многих гибридом.

Микроскопические колонии гибридом можно заменить на 4–8-й день после слияния. При просматривании колоний снизубелые колонии гибридом будут заметны через 10 дней после гибридизации. Так как антителопродуцирующие клетки могут быть смешаны с непродуцирующими,необходимо немедленное их клонирование сразу же после установления продукции специфических антител.