1. Современный иммунохимический анализ и его место в биохимическом микроанализе.

Иммунохимические методы анализа, основанные на специфическом связывании определяемого соединения соответствующими антителами, широко вошли в аналитическую практику и используются в различных областях медицины, сельского хозяйства, микробиологической и пищевой промышленности, для целей охраны окружающей среды. Иммунохимическая реакция в растворе между антителами и антигенами протекает в несколько стадий, первой из которых является обратимое образование комплекса состава 1: 1. Вследствие наличия в молекуле антител более одного центра связывания для поливалентных антигенов возможно дальнейшее многостадийное образование сложных комплексов с различным соотношением в нем компонентов.

Классические методы иммунохимического анализа основаны на образовании антителами в присутствии антигена преципитата (осадка), однако для визуальной регистрации процесса преципитации необходимы высокие концентрации компонентов и длительное время проведения реакции. Результаты такого анализа не всегда можно однозначно интерпретировать и, кроме того, в большинстве случаев они носят качественный или полуколичественный характер. Кроме того, для многих одновалентных антигенов (гаптенов), например гормонов, лекарственных соединений, эти методы непригодны.

Индикация образовавшегося комплекса антиген — антитело в растворе может быть осуществлена, если в один из исходных компонентов реакционной системы ввести метку, которая легко детектируется соответствующим высокочувствительным физико-химическим методом. Весьма удобными для этой цели оказались изотопные, ферментные, флуоресцентные, парамагнитные метки, использование которых дало возможность увеличить чувствительность иммунохимических методов в миллионы раз, а время анализа уменьшить до нескольких часов.

Для достижения высокой специфичности, чувствительности, вос-производимости, экспрессности и автоматизации иммунохимических анализов принципиально возможным является использование только первой стадии простого иммунохимического взаимодействия. Так как процесс комплексообразования пары анализируемое соединение (антиген) —специфическое антитело происходите строго количественном соотношении, то экспериментально устанавливаемая концентрация метки, входящей в состав образующегося иммунохимического комплекса, однозначно связана с исходной концентрацией антигена.

Для осуществления такого анализа необходимо провести эффективное разделение комплексов от свободных компонентов. Эту задачу оказалось легко решить, если один из компонентов пары антиген — антитело прочно иммобилизовать (связать) на твердом носителе. Иммобилизация позволяет предотвратить агрегацию в растворе и осуществить физическое разделение образующихся иммунных комплексов от свободных компонентов. Возможность прочного связывания на носителе антител или антигенов с сохранением их способности к специфическому образованию иммунных комплексов и разработка на этом принципе твердофазных методов дали мощный импульс для развития новых подходов в иммунохимических методах анализа.

Новые иммунохимические методы, основанные на применении меченых реагентов, нашли широкое распространение для количественного определения биологически активных соединений самой разнообразной структуры — от низкомолекулярных гормонов до высокомолекулярных вирусов и целых клеток.

Наибольшее развитие среди них получил радиоиммунологический анализ (РИА), предложенный в конце 50-х годов. Благодаря возможности определять метку, которой являлся изотоп ¹²⁵I, в очень малых концентрациях, удалось достигнуть высокой чувствительности анализа (на уровне пкг/мл). Разработка РИА явилась поворотным моментом в развитии иммунохимических методов анализа, положившим начало целой серии методов с использованием различных меченых соединений. За разработку метода его авторы Р. Йалоу и С. Берсон в 1977 г. были удостоены Нобелевской премии.

РИА имеет и определенные недостатки, к которым можно отнести следующие: 1) ограниченный срок жизни радиоактивной метки, что вызывает необходимость постоянной замены реактивов; 2) относительно дорогое специальное оборудование для регистрации радиоактивности; 3) возможность радиоактивного заражения окружающей среды при осуществлении большого количества анализов, что вызывает необходимость соблюдения специальных мер предосторожности и высокой квалификации обслуживающего персонала. Именно эти трудности послужили исходным моментом для поиска методов, альтернативных РИА, но сохраняющих его высокую чувствительность, специфичность и экспрессность.

В середине 60-х годов для идентификации и локализации антигенов в гистохимических препаратах и выявления полос преципитации в иммунодиффузионных и иммуноэлектрофоретических методах в качестве высокочувствительной метки было предложено использовать молекулы ферментов.

На протяжении последних двух десятилетий иммуноферментные методы анализа интенсивно развивались как в теоретическом, так и практическом плане и к настоящему времени они сформировались в самостоятельное научное направление, имеющее важное прикладное значение.

Метод ИФА находится в постоянном развитии. С одной стороны, расширяется число объектов исследования, с другой — углубляются и совершенствуются методы самого анализа. Это приводит к тому, что упрощается схема анализа, сокращается время его проведения, уменьшается расход реагентов. Идет постоянный поиск все новых и новых ферментов, используемых в качестве маркеров.