9. Структурные основы антигенной специфичности белков

9. Структурные основы антигенной специфичности белков

 

Понятие антигенная детерминанта (АД) включа­ет в себя последовательность образующих ее химических функцио­нальных групп и их пространственное расположение.

АД белков бывают двух типов — секвен­циальные, т. е. представляющие из себя последовательность ами­нокислотных остатков в полипептидной цепи, и конформационные, образованные аминокислотными остатками из различных частей белковой цепи, и сближенные в пространственной конфигурации белковой глобулы. Во многих случаях единичная замена аминокислоты в структуре АД или изменение конформации белковой глобулы являются достаточными для изменения антигенной спе­цифичности макромолекулы.

Термин «специфичность антигена» используется в двух смыс­лах: а) как способность избирательно реагировать со спе­цифическими антителами, б) поскольку белковые антиге­ны поливалентны, как набор определенных АД.

Некоторые АД у белков с четвертичной структурой могут быть образованы фрагментами полипептидных цепей различных субъединиц, как, например, в иммуноглобулинах и гемоглобине. АД белков образована группой аминокислотных остатков, сре­ди которых можно выявить иммунодоминантную группу (приме­р - С-концевой аргинин декапептида бел­ка вируса табачной мозаики). Размер АД белков может варьировать от 5—7 до 20 аминокис­лотных остатков.

Наиболее характерно эффект иммунодоминантной группы вы­является при модификации отдельных аминокислотных остатков химическими соединениями, например динитрофенильной группой. Антитела, образующиеся в такой модифицированной АД, способны реагировать не только с ней, но и с дру­гими аминокислотными остатками, к которым будет «пришита» динитрофенильная группа. Более того, если в раствор, содержа­щий модифицированный белок и антитела, добавить свободный динитрофенол, то он будет ингибировать образование комплекса антиген — антитело. Это явление, которое впервые было описано и детально изучено Ландштейнером, послужило основой для получения антител против различных гаптенов.

Существенный вклад в понимание структуры АД внесли работы по изучению антигенности синтетических пептидов. Классическим примером являются работы по синтезу пептидной петли лизоцима, которая является самостоятельной АД (остатки 64—82). Было показано, что эта петля, содержащая внутреннюю дисульфидную связь, взаимо­действует с антителами, получаемыми как против лизоцима, так и самой петли, однако образование комплекса не происходит, если дисульфидная связь восстановлена. Это свидетельствует о том, что структура АД и ее специфичность зависят как от аминокислотной последовательности, так и от конформации данного фрагмента. Общим для АД является то, что они, как правило, находятся на поверхности белковой гло­булы и образованы жесткими а-спиральными участками.

Существует несколько путей исследования структуры АД: а) основан на искусственном синтезе фрагментов первичной структуры, в которых проводятся замеще­ния отдельных аминокислот; б) изучение влияния изби­рательной модификации отдельных аминокислотных остатков; в) сравнение между собой гомологичных антигенов(например, инсулин разных видов животных).

 

10. Физико-химические свойства ферментов, используемых в ИФА. Щелочная фосфатаза.

 

Ферментные маркеры, используемые в ИФА, должны обладать следующими свойствами:

– высокая активность и стабильность фермента в условиях анализа, при модификации и в конъюгате с антителами или другими белками;

– наличие чувствительных субстратов и простота метода определения продуктов или субстратов ферментативной реакции;

– возможность адаптации субстратных систем к дальнейшему усилению;

– отсутствие фермента и его ингибиторов в исследуемой биологической жидкости.

В ИФА может использоваться не менее 15 различных ферментов. Наибольшее применение, в соответствии с вышеназванными требованиями, нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфотаза (ЩФ) и β -D-галактозидаза. Все три стабильны и катализируют высокочувствительные реакции. Кроме того, продукты, получаемые в результате реакций, катализируемых этими ферментами, в зависимости от используемого субстрата, могут выявляться не только колориметрическими методами, но также флуоресцентными методами. Другие ферменты используются значительно реже. Это объясняется их более низкой в сравнении с ПХ и ЩФ удельной активностью.

Щелочная фосфатаза.

Структура. Продажными препаратами ЩФ являются фермент из кишечника телят и из Е. coli. В качестве метки в иммуноферментном анализе обычно используют первый из них, так как он обладает более высокой удельной каталитической активностью. Молекула ЩФ представляет собой димер с М~100 000. В состав каждой из субъединиц, входят два сильно связанных атома цинка, один из которых существен для поддержания структурной целостности молекулы, а второй входит в состав активного центра и принимает участие в каталитическом акте.

Специфичность. ЩФ катализирует гидролиз различных ортофосфатных эфиров, в том числе первичных и вторичных спиртов, сахарных спиртов, циклических спиртов и фенолов:

моноэфир ортофосфорной кислоты +Н20=спирт+РО₄^3-

Ионы Mg²⁺ являются сильными активаторами фермента. Фосфат- ион и хелаты двухвалентных металлов, например ЭДТА, ингиби­руют фермент. На активность ЩФ значительное влияние оказывает электростатическое окружение (ионная сила, растворитель).

В сухом виде или в суспензии (3, 2 М раствора сульфата ам­мония), pH 7, содержащего 1 мМ MgCl, ЩФ стабильна в течение нескольких месяцев при 4°С Методы определения:

1) Фотометрический метод определения каталитической активности щелочной фосфатаэы с использованием 4-нитрофенилфосфата.

2) Флуориметрический метод определения ферментативной актив­ности с использованием 4-метилумбеллиферилфосфата.

 

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться:

Воспользуйтесь поиском по сайту: