 |
2. Гомогенно-гетерогенные методы ИФА.
|
|
|
|
2. Гомогенно-гетерогенные методы ИФА.
Гомогенно-гетерогенные реакции – образование комплекса идет в растворе и только потом для разделения используют иммобилизованный на носителе агент. 
Определение Аг с мечеными вторичными Ат и иммобилизованного Аг
3. Общая характеристика иммуноферментного анализа; преимущества и недостатки фермент-зависимых меток. Области применения ИФА.
ИФА – метод выявления Аг и Ат, основанный на определении комплекса Аг-Ат за счет введения в один из компонентов реакции ферментативной метки с последующей ее детекцией с помощью соответствующего субстрата, изменяющего свою окраску. Основой проведения любого варианта ИФА служит определение продуктов ферментативных реакций при исследовании тестируемых образцов в сравнении с негативными и позитивными контролями.
Иммуноферментный анализ по сравнению с другими методами детекции антигенов и антител обладает следующими преимуществами:
· ↑ чувствительностью, позволяющей выявлять концентрации до 0, 05 нг/мл (определяется способностью одной молекулы фермента катализировать превращение большого числа молекул субстрата);
· возможностью использовать мин. объемы исследуемого материала;
· стабильностью при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА;
· простотой проведения реакции;
· наличием как инструментального (в качественном и количественном варианте), так и визуального учета;
· отсутствием радиационной опасности;
· возможностью усиления сигнала;
· возможностью автоматизации всех этапов реакции относительно ↓ стоимостью диагностических наборов.
Разнообразие объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием условий применения ИФА, обусловливают разработку чрезвычайно большого количество вариантов этого метода.
|
|
|
Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:
1. стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему Ат, что ведет к образованию иммунного комплекса;
2. стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;
3. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал.
Недостаток - относясь к непрямым методам диагностики, он позволяет определить иммунный ответ организма на возбудителя, а не самого возбудителя.
К выбору ферментных меток в ИФА предъявляется ряд общих требований:
а) высокая специфичность и удельная каталитическая активность фермента, позволяющая обнаруживать ферментативную метку в низких концентрациях;
б) доступность ферментов; возможность получения достаточно чистых ферментных препаратов, сохраняющих высокую ферментативную активность после химической модификации при получении конъюгата с антителами или антигенами;
в) стабильность в оптимальных условиях взаимодействия антигена с антителом;
г) простота и чувствительность метода определения концентрации фермента.
Для ферментативной метки антигенов или антител могут быть применены разнообразные ферменты: пероксидаза хрена, щелочная фосфотаза, β -галактозидаза и т. д. В качестве субстратного реагента наиболее часто применяется орто-фенилендиамин (ОФД) с перекисью водорода, продукт окисления которого регистрируется фотометрически. Для остановки ферментативной реакции применяют “стоп реагент”, который добавляют во все исследуемые и контрольные пробы в равных количествах. Наиболее часто в качестве “стоп реагента” применяют H2SO4.
|
|
|
Чувствительность многих вариантов иммуноферментных методов анализа может быть ограничена наименьшей регистрируемой концентрацией ферментативной метки в растворе, поэтому чем в более низкой концентрации возможно определение меченного ферментом антигена или антитела, тем лучшими характеристиками будет обладать данный метод ИФА.
Области применения:
–Медицина: диагностика вирусных заболеваний (герпес), инфекции передающиеся половым путем (хламидиоз, сифилис), онкомаркеры, аллергология, эндокринология и т. д. Также ИФА применяется для анализа лекарственных средств, допинга; различных физиологических состояний организма (ранняя диагностика беременности, патологии протекания беременности).
–Ветеринария: три основные сферы применения иммунодиагностики на базе ИФА и агглютинации в ветеринарии: 1) оценка фертильности; 2) диагностика инфекционных заболеваний; 3) обнаружение токсинов и остаточных количеств различных веществ.
–С/х и др.
|
|
|
