 |
18. Сравнительная оценка различных схем проведения гетерогенного ИФА.
|
|
|
|
18. Сравнительная оценка различных схем проведения гетерогенного ИФА.
Выбор схемы анализа зависит от многих факторов, из которых основными являются молекулярная масса и валентность антигена, длительность анализа, состав среды, в которой необходимо определять антиген, свойства фермента, используемого в качестве маркера и т. д.
Методы гетерогенного ИФА основаны на использовании меченных ферментом антигенов или антител. При наличии меченого антигена проводят анализ с использованием малостадийных конкурентных схем. Если метка введена в высокоочищенный антиген, то на конечной стадии можно измерить активность конъюгата, не связанного с иммобилиз. антителами, что позволяет исключить этап отмывки иммуносорбента и делает анализ удобным для автоматизации.
С другой стороны, анализ на основе меченых антигенов сопряжен с рядом сложностей. Разнообразие строения и физико-химических свойств антигенов препятствуют созданию универсальных методов получения антиферментных конъюгатов. Схема введения метки в один антиген часто оказывается неприемлемой при переходе к другому.
Основной проблемой является доступность антигенных детерминант в образовавшемся конъюгате для взаимодействия с антителами. При использовании меченных гаптенов необходимо, чтобы связь маркера с ним осуществлялась через ту же функциональную группу, которая модифицировалась для синтеза конъюгата белок-гапнет для целей иммунизации и получения антител. Это накладывает дополнительные требования на выбор фермента-маркера. Кроме того, разделение конъюгата гаптен-фермент от несвязавшегося фермента, примесь которого может оказывать негативное влияние на результаты анализа, крайне затруднительно. Другим существенным условием получения меченных гаптенов является доступность очищенного антигена в значительном количестве, что осуществимо далеко не всегда.
|
|
|
Получение меченных антител для анализа методически более просто. С помощью имеющихся стандартных методик получают активные и стабильные препараты, что упрощает разработку методов иммуноферментного определения различных соединеий. В ИФА могут использоваться меченая глобулиновая фракция или IgG-фракция антител, афинно выделенные антитела или Fab-фрагменты.
Применение в анализе меченых антивидовых антител упрощает процедуру получения реагентов для анализа, т. к. позволяет, используя одни и те же конъюгаты, осуществлять определения разных антигенов и антител различной специфичности. Однако такой подход усложняет проведения анализа из-за введения дополнительных стадий инкубации и промывки носителя.
Те же задачи могут решаться при использовании конъюгатов фермента с белком А стафилококка, способного образовывать прочный комплекс с Fc-фрагментом иммуноглобулинов. Белок А стабилен в растворим. И лиофилиз. Состоянии, что позволяет на его основе получать коммерческие «универсальные» конъюгаты с пероксидазой и щелочной фосфатазой. Белок А с различной эффективностью взаимодействует с IgG разных млекопит. И не реагирует с IgG птиц.
При сравнении конкурентных и неконкурентных методов можно отметить следующее. Во-первых, как вытекает из теоретического анализа, конкурентные методы обладают меньшей чувствительностью по сравнению с неконкурентными. Предел обнаружения различных соединений для них ограничен как чувствительностью регистрации ферментной метки, так и аффинностью антител, в то время как для неконкурентных методов, при отсутствии неспецифических взаимодействий, - только чувствительностью определения фермента.
|
|
|
Вторым общим недостатком конкурентных методов ИФА является возможность влияния различных эффекторов, содержащихся в анализируемых био жидкостях, на каталитические свойства ферментной метки. Во многих случаях это можно устранить путем многократного разведения исходного образца.
19. Специфичность и гетерогенность антител, перекрестная реактивность. Понятие аффинности и авидности антител.
1. Специфичность — способность взаимодействия с определенным (своим) антигеном (соответствие эпитопа антигена и активного центра антител).
2. Валентность - количество способных реагировать с антигеном активных центров ( это связано с молекулярной организацией- моно- или полимер). Иммуноглобулины могут быть двухвалентными ( IgG ) или поливалентными (пентамер IgM имеет 10 активных центров). Двух- и более валентные антитела навывают полными антителами. Неполные антитела имеют только один участвующий во взаимодействии с антигеном активный центр (блокирующий эффект на иммунологические реакции, например, на агглютинационные тесты). Их выявляют в антиглобулиновой пробе Кумбса, реакции угнетения связывания комплемента.
3. Афинность — прочность связи между эпитопом антигена и активным центром антител, зависит от их пространственного соответствия.
4. Авидность — интегральная характеристика силы связи между антигеном и антителами, с учетом взаимодействия всех активных центров антител с эпитопами. Поскольку антигены часто поливалентны, связь между отдельными молекулами антигена осуществляется с помощью нескольких антител.
5. Гетерогенность — обусловлена антигенными свойствами антител, наличием у них трех видов антигенных детерминант:
- изотипические — принадлежность антител к определенному классу иммуноглобулинов;
- аллотипические- обусловлены аллельными различиями иммуноглобулинов, кодируемых соответствующими аллелями Ig гена;
- идиотипические- отражают индивидуальные особенности иммуноглобулина, определяемые характеристиками активных центров молекул антител. Даже тогда, когда антитела к конкретному антигену относятся к одному классу, субклассу и даже аллотипу, они характеризуются специфическими отличиями друг от друга (идиотипом). Это зависит от особенностей строения V- участков H- и L-цепей, множества различных вариантов их аминокислотных последовательностей.
|
|
|
6. Перекрестная реактивность
Реакциям антиген-антитело свойственна высокая специфичность. Однако, если антиген А имеет общие эпитопы с антигеном Б, часть антител, специфичных к А, будет реагировать также с Б. Этот феномен назван перекрестной реактивностью.
Несмотря на то что основным критерием в иммунологии является специфичность, иммунологическая перекрестная реактивность наблюдается на многих уровнях. Это не означает, что роль иммунологической специфичности уменьшается, а скорее указывает на то, что соединения, обладающие перекрестной реактивностью, имеют одинаковые антигенные детерминанты. В случаях наличия перекрестной реактивности антигенные детерминанты веществ, обладающих перекрестной реактивностью, могут иметь идентичные химические структуры или состоять из одинаковых, но не идентичных физико-химических структур.
Существуют и другие примеры иммунологической перекрестной реактивности, в которых два вещества, обладающие ею, не родственны друг другу за исключением того, что обладают одним или более общими эпитопами, точнее одним или более участками, имеющими одинаковые трехмерные характеристики. Эти вещества относят к гетерофильным антигенам. Например, антигены группы крови А человека реагируют с антисывороткой, полученной против полисахарида капсулы пневмококка. Таким же образом, антигены группы крови В человека реагируют с антителами к определенным штаммам Escherichia coli. В этих примерах перекрестной реактивности антигены микроорганизмов относятся к гетерофильным антигенам (относительно антигенов групп крови).
|
|
|
