 |
4. Гомогенные методы ИФА, основанные на использовании антител против активного центра фермента.
|
|
|
|
4. Гомогенные методы ИФА, основанные на использовании антител против активного центра фермента.
При использовании сывороточного альбумина человека как модельного антигена разработан гомогенный ИФА, основанный на конкурентном связывании с конъюгатом F – Аг двух типов Ат: специфических Ат против определяемого Аг и Ат против F, вызывающих при связывании полную потерю его каталитической активности. Вследствие стерических затруднений связывание с конъюгатом Ат против Аг приводит к потере способности взаимодействия Ат второй специфичности с F. В присутствии определяемого Аг доля специфических Ат, связанных с конъюгатом, ↓, что приводит к ↑ [c] ферментативно неактивных комплексов конъюгата с Ат против F и снижению экспериментально регистрируемого сигнала. Ниже приведена схема метода:
|
|
Были синтезированы конъюгаты сывороточного альбумина человека с аденозиндезаминазой — F, катализирующим гидролиз аденозина с образованием инозина и аммиака. Для регистрации ферментативной активности использовали чувствительный к аммиаку ионселективный электрод. Метод прост и позволяет определить белок в [c] ~ 1 мкг/мл.
5. Гаптены.
Гаптены-это вещества, способные связываться с антителами, но не являющиеся иммуногенами.
Гаптены в конъюгатах с белком выступают в роли иммунодоминантной группы и поэтому в дальнейшем могут взаимодействовать с антителами независимо от белка носителя. В качестве гаптенов могут выступать органические вещества с Mr> 100. Важными являются стероидные и пептидные гормоны, широкий круг лекарственных соединений (антибиотики, сердечно-сосудистые препараты), пестициды, различные продукты промышленного органического синтеза, обладающие аллергенным действием. Антигенная специфичность гаптенов сильно зависит от их химической структуры. Так, введение дополнительных групп может сильно исказить «антигенный портрет» того или иного соединения. Например, тироксин и трийодтиронин отличаются только одним остатком I, чего вполне достаточно, чтобы антитела против этих гормонов сильно различались перекрестной реактивностью.
|
|
|
Важным моментом является стереоспецифичность гаптенов; антитела против олигопептидов из D-аминокислот не реагируют с олигопептидами из L-аминокислот. На антигенную специфичность сильное влияние оказывают аминокислотный остаток белка носителя, к которому пришит гаптен, а также молекулярные размеры гаптена. Так, в длинных олигопептидных гаптенах замена аминокислотных остатков, которые расположены близко к белку-носителю, оказывают меньшее влияние, чем в коротких.
Антигенная специфичность гаптенов зависит не только от их химической структуры, но и от способа пришивки к белку-носителю, в частности от того, какая функциональная группа гаптена была использована для конъюгирования. Часто при получении конъюгатов для иммунизации гаптены пришивают не непоспредственно к молекуле белка-носителя, а через пространственную «ножку», содержащую обычно 4-6 углеродных атомов. В этом случае сама «ножка» в комплексе с гаптеном выступает в качестве составной антигенной детерминанты и образующиеся антитела могут обладать меньшей эффективностью связывания с нативным гаптеном, чем с таким связанным через «ножку» гаптеном. В некоторых видах ИФА в качестве одного из реагентов используют гаптен, меченный ферментом. Если связывание в таком конъюгате аналогично способу пришивки в конъюгате гаптена с белком-носителем для получения антител, то говорят, что в анализе используют гомологичные антитела. Если же структура «ножки» и способ пришивки гаптена в обоих случаях различны, то говорят о гетерологичных антителах. Весьма существенным фактором для специфичности является химическая структура «ножки», в частности ее длина и ближайшее окружение гаптена. Знание антигенной структуры и специфичности гаптенов имеет важное значение для создания методов иммунохимического определения различных физиологически активных соединений, т. к. многие из них претерпевают различные биохимические превращения, в результате чего образуется группа близкородственных метаболитов.
|
|
|
6. Гомогенные методы ИФА антигенов, основанные (I) на изменении активной конформации фермента, индуцируемом антителами; (II) на эффекте ингибирования фермента-метки.
Индуцируемое антителами изменение активной конформации фермента(I). Известно, что в результате комплексообразования антител с антигенами в молекулах реагирующих соединений могут происходить конформационные изменения. Такие же структурные изменения в молекулах ферментов могут наблюдаться при связывании антител с конъюгатами антиген-фермент. Если в результате такого взаимодействия фермент переходит в другую конформацию, при которой его каталитическая активность сильно меняется, то это явление может быть положено в основу методов гомогенного ИФА.
На практике данный подход был реализован на примере многих низкомолекулярных антигенов и других ферментов-малатдегидрогеназы печени свиньи и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, и также известен под названием «EMIT». Используют конъюгаты ферментов с гаптенами, которые незначительно отличаются по активности от нативного фермента. При взаимодействии с антителами против гаптена в молекуле фермента происходят конформационные изменения, затрагивающие структуру активного центра, в результате чего ферментативная активность сильно падает. Введение в реакционную систему свободного антигена приводит к уменьшению концентрации комплексов конъюгат-антитело, а следовательно, измеряемая активность при увеличении концентрации анализируемого соединения также возрастает.
Для некоторых гаптенов(тироксин и триийодтиронин) оказалось, что их ковалентное связывание с ферментом приводит к полному падению его каталитической активности, обусловленному относительной подвижностью находящегося в непосредственной близости от активного центра фермента гаптена и возможным ингибирующим его действием на связывание субстрата. В свободном состоянии конъюгат неактивен, но его связывание с антителами приводит к реактивации фермента и степень реактивации однозначно связана с концентрацией определяемого гаптена в растворе.
|
|
|
ИФА, основанный на эффекте ингибирования субстратом фермента-метки(II). В качестве метки антигена используют пероксидазу хрена. Принцип метода основан на значительном отличии ферментативной активности исходного конъюгата и конъюгата в комплексе со специфическими антителами при детекции метки в присутствии 35мМ перекиси водорода, которая является субстратом пероксидазы. Пероксидаза нативная и в конъюгате с антигеном в значительной степени ингибируется уже при концентрации перекиси 10мМ, но сохраняет активность в конъюгате при связывании с соответствующими антителами. Новый подход апробирован на примере альфа-фетопротеина, ферритина, β 2-микроглобулина, иммуноглобулина E. При длительности 20-30 мин метод позволяет определять до 10 нг/мл альфа-фетопротеина, что сопоставимо с чувствительностью гетерогенного ИФА.
|
|
|
