 |
11. Общая характеристика структуры молекул иммуноглобулинов.
|
|
|
|
11. Общая характеристика структуры молекул иммуноглобулинов.
Ат – особый вид белков, называемых Ig, к-рые выраб-ся под влиянием Аг и обл-ют способностью специф-ки реагировать с ними.
Ат в организме выполняют две осн. ф-ции. Первая — это распознавание и специфическое связывание соответств-их Аг, вторая — эффекторная, заключающаяся в индукции важнейших физиол-их процессов, направл-ых на уничтожение Аг: лизис чужеродных клеток через активацию системы комплемента, стимуляция специализир-х иммунокомпетентных клеток, выделение фармакологически активных в-в и т. д.
Иммуноглобулины по своей хим-ой структуре относятся к большому классу природных соединений — гликопротеидам, высокомолекулярным соедин-ям, состоящим из послед-сти L-аминокислот, соед-ых между собой пептидными связями. Кроме аминокислот в структуру иммуноглобулинов включены олигосахариды.
По своим антигенным, эффекторным свойствам и структурным особенностям иммуноглобулины подразделяются на пять основных классов: IgM, IgG, IgA, IgD и IgE.
Общей структурной единицей всех иммуноглобулинов является комплекс из четырех полипептидных цепей — двух идентичных между собой легких цепей с молекулярной массой 23000 каждая (L-цепи, от английского слова light — легкий) и тяжелый с м. м по 53000 (Н-цепи, от английского heavy — тяжелый).
Каждая из лёгких цепей прочно соединена с NH2-концевыми участками тяжелых цепей благодаря наличию межцепочечных S-S связей и множеству слабых гидрофобных, электростат-х и др. межатомных взаимодействий. Аналогичные связи существуют и между свободными участками тяжелых цепей. В целом структура такого комплекса напоминает латинскую букву «Y» или «Т» и характерна для иммуноглобулинов классов IgG, IgD и IgE.
|
|
|
При действии протеолитического фермента папаина молекула IgG распадается на три фрагмента, два из которых идентичны и сохраняют способность связывать антигены (так называемые Fab-фрагменты, и третий, способный к кристаллизации (так называемый Fc-фрагмент. Именно Fc-фрагмент ответствен за эффекторную функцию антител — связывание белка комплемента Clq, транспорт через мембраны, взаимодействие с мембр-ми R и т. д.
Др. протеолитич-й Е пепсин " разрывает пептидную связь, расположенную ближе к СООН-концу цепи, от S—S-связи между Н-цепями в Fc-фрагменте. В результате образ-ся т. н. pFc΄ –фрагмент, представляющий собой остатки тяжелых цепей, и соед-е S-S связями два Fав-фрагмента, обозначаемые как F(ав')2-фрагмент (также сохраняет способность к связ-ю Аг).
Агсвяз-щий центр расположен в NН2-концевых частях Н- и L-цепей.
Таким образом, каждая молекула IgG, а также F(ab')2-фрагменты содержат по два антигенсвязывающих центра, а Fab-фрагмент — один.
Необходимым условием для использования антител в ИФА является сохранение их способности специфически взаимодействовать с соответствующими антигенами.
У Ч. выделяют 5 типов Н-цепей (альфа, гамма, дельта, эпсилон и мю) и 2 типа L-цепей (каппа и лямбда).
Часто используют не целые мол-лы Ат, а только их фрагменты F(ab')2 или Fab. Такой подход позволяет в некоторых случаях устранить неспецифические реакции, обусловленные, в частности, ' взаимодействием Fc-фрагментов с поверхн-ми носителей.
Молекулы антител имеют большое число S—S-связей, которые можно разделить на 3 категории:
• межцепочечные связи, образуемые внутри структурной единицы между Н- и L-цепями и между Н- и Н-цепями,
• внутрицепочечные S—S-связи, возникающие в пределах одной и той же легкой или тяжелой цепи (обычно 2 в легкой и 4 в тяжелой цепи),
• связи между Н-цепями отдельных четырехцепочечных комплексов, обусловливающих образование полимерных молекул — IgM и IgA.
|
|
|
IgM присутствует в сыв. в виде пентамера 4-хцепочечных комплексов, соед-х S—S-связями между Н-цепями. Нек-рое кол-во IgA сыв. также присутствует в виде димерной и тетрамерной формы.
Все легкие и тяжелые цепи имеют одну принципиальную структурную особенность: они состоят из двух частей — вариабельной (V) и константной (С). Вариабельные части легких цепей сильно отличаются друг от друга у всех исслед-х Ig, а константные имеют близкую АК послед-ть в пределах одного класса, как легких, так и тяжелых цепей.
Сущ-ют гипервариабельные участки, включ-е разные а. о. с различными ФГ; происх. замены АК-т.
• ШАРНИРНЫЙ УЧАСТОК (ОБЛАСТЬ). Сегмент H-цепей, соед-й Fab-фрагмент с Fc-частью мол-лы. У гамма, альфа и дельта-цепей Ш. области не похожи на домены. Вторые домены С-обл-ей у мю и эпсилон-цепей напоминают Ш. области.
Содержат много остатков пролина.
• УГЛЕВОДЫ. Ряд олигосахаридов расп-ся в гомолог-х положениях, как правило, между доменами или на их пов-ти. Обычно прикреплены к пост-ным обл-ям Н-цепей, за искл. редких случаев, когда акцепторный трипептид Asn-X- Ser/Thr имеется и в вариаб-х обл-х.
Гликозил-е осущ-ся на посттрансляц-ом ур-не.
12. Гомогенные и гетерогенные схемы ИФА. Сравнительная характеристика.
При класиффикации методов ИФА по типу проводимых на каждой из иммунохимических стадий реакций все методы можно разделить на две группы — гомогенные и гетерогенные.
Если в ходе выполнения анализа все реакции, включая ферментативную стадию, протекают в растворе, то метод является гомогенным. В нем отсутствует стадия разделения образующихся иммунохимических комплексов от свободных, не вступивших в реакцию компонентов. Определение концентрации исследуемого соединения основано на эффекте изменения каталитической активности фермента-метки, -возникающем при комплексообразовании с исследуемым лигандом или центрами специфического связывания.
К гомогенным относятся методы, осуществляемые в однофазной системе, и не требующие стадии механического разделения образовавшихся комплексов. Во всех схемах проведения гомогенного иммуноферментного анализа регистрируется концентрация не образующегося специфического комплекса антитело-антиген, а оставшихся свободными центров специфического связывания. Однако, в противоположность гетерогенным схемам, наблюдаемая ферментативная активность, соответствующая концентрации незанятых мест специфического связывания, может как уменьшаться, так и увеличиваться, что обусловлено различной природой воздействия связывания лигандов на ферментнативную активность. Введение метки в молекулу антигена является одним из наиболее распространенных подходов в гомогенных методах иммуноферментного анализа. Все гомогенные методы относятся к конкурентным и основаны на одновременном взаимодействии с антителами анализируемого и меченого антигенов. После образования в растворе соответствующего иммунохимического комплекса проводят измерение ферментативной активности, которая пропорциональна концентрации свободного или связанного меченого лиганда.
|
|
|
Гетерогенный ИФА объединяет методы, в которых анализ проводится в двухфазной системе, при этом разделение на фазы может происходить на любой стадии определения. Гетерогенные методы включают обязательную стадию разделения свободного и образовавшего специфический комплекс меченого соединения, которые находятся в разных фазах.
Основными достоинствами гетерогенных методов ИФА является высокая чувствительность, возможность определения соединений с различной молекулярной массой (от гаптенов до целых кЛлеток), возможность анализа образцов, содержащих ингибиторы и активаторы фермента- маркера.
Развивающиеся в настоящее время кинетические методы твердофазного ИФА, а также ИФА на основе водорастворимых полимеров открывают возможность «экспресса-анализа исследуемых веществ.
|
|
|
