 |
16. Конкурентные и неконкурентные схемы ИФА. Сравнительная характеристика.
|
|
|
|
IgM
Иммуноглобулины М – это наиболее «ранние» из всех классов ИГ, включающие 2 субкласса: IgMl (65%) и IgM2 (35%). Период их полураспада составляет 4-8 суток. Они не проникают через плаценту. IgM появляется у плода и участвует в антиинфекционной защите. Они способны агглютинировать бактерий, нейтрализовать вирусы, активировать комплемент. IgM играют важную роль в элиминации возбудителя из кровеносного русла, в активации фагоцитоза. IgM – это антитела, образующиеся на ранних сроках инфекционного процесса. Они отличаются высокой активностью в реакциях агглютинации, лизиса и связывания эндотоксинов грамотрицательных бактерий.
IgA
Иммуноглобулины А – это секреторные ИГ, включающие 2 субкласса: IgAl (90%) и IgA2 (10%). Период полураспада антител составляет 4-5 суток. IgA содержится в молоке, молозиве, слюне, в слезном, бронхиальном и желудочно-кишечном секрете, желчи, моче. В состав IgA входит секреторный компонент, состоящий из нескольких полипептидов, который повышает устойчивость IgA к действию ферментов. Это основной вид ИГ, участвующих в местном иммунитете. Они препятствуют прикреплению бактерий к слизистой, нейтрализуют энтеротоксин, активируют фагоцитоз и комплемент. IgA не определяется у новорожденных.
IgE
Иммуноглобулины Е — это мономеры, содержание которых в сыворотке крови ничтожно мало –0. 002% от общего количества ИГ. Период их полураспада в сыворотке крови составляет 2-3 дня, а в коже -9-14 дней. К классу IgE относится основная масса аллергических антител – реагинов. Уровень IgE значительно повышается у людей, страдающих аллергией и зараженных гельминтами. Вызывающих аллергические реакции немедленного типа.
16. Конкурентные и неконкурентные схемы ИФА. Сравнительная характеристика.
|
|
|
Если на первой стадии в системе присутствует только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания, то метод неконкурентный.
Если – одновременно анализируемое вещество и его аналог, то метод конкурентный. Необходимое условие – недостаток центров специфического связывания по отношению к веществу и аналогу.
Неконкурентные методы
На несколько видов по типу детекции (прямой конкурентный, косвенный конкурентный) и по типу иммобилизованного на твердой фазе вещества (антиген, антитело).
Прямой метод. Подразделяется на два вида анализа:
1) исследуемое вещество непосредственно иммобилизовано на твердую фазу; связавшееся с антигеном меченое антитело является детектором;
2) на твердой фазе иммобилизованы антитела; детектором является исследуемое вещество, меченое ферментативной меткой.
Косвенный (непрямой) метод. АГ иммобилизован на твердую фазу. После блокировки, к антигену добавляют раствор специфических к нему антител. После инкубации, комплекс антиген-антитело отмывают от несвязавшихся антител и добавляют меченый анти-иммуноглобулин (анти-Ig), выступающий в роли детектора. Использование меченого анти-Ig усиливает сигнал по сравнению с прямым методом иммуноферментного анализа, тем самым увеличивая чувствительность анализа.
«Сэндвич»-метод. Наиболее распространенный неконкурентный. К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации на первой стадии на твердой фазе образуется комплекс антиген-антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом специфические антитела. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена. На стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченных антител, что послужило поводом для широкого распространения названия «сэндвич»-метод. Ферментативная реакция (цветная реакция) проходит в присутствии перекиси водорода и субстрата, представленного неокрашенным соединением, которое в процессе пероксидазной реакции окисляется до окрашенного продукта реакции на заключительном этапе проведения исследования. Интенсивность окрашивания зависит от количества выявленных специфических антител. Результат оценивается спектрофотометрически или визуально.
|
|
|
Конкурентные методы
На несколько видов по типу детекции (прямой конкурентный, косвенный конкурентный) и по типу иммобилизованного на твердой фазе вещества (антиген, антитело).
1) Прямой конкурентный метод ИФА использует иммобилизованые на твердой фазе специфические антитела, а меченый ферментом и немеченый антиген конкурируют за связь с иммобилизованным антителом.
К иммобилизованным антителам добавляют раствор, содержащий определяемое вещество и фиксированную концентрацию меченого антигена, инкубируют и после отмывки носителя от несвязавшихся компонентов регистрируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов. Величина детектируемого сигнала находится в обратной зависимости от концентрации антигена.
Преимуществом прямой схемы является небольшое число стадий, что позволяет легко автоматизировать анализ. К недостаткам схемы относятся сложность методов синтеза ферментных конъюгатов, а также возможное влияние компонентов образца на активность фермента.
2) В непрямом конкурентном методе ИФА используются меченные ферментом антитела (специфические или вторичные) и иммобилизованный на твердой фазе конъюгат антиген-белок-носитель.
Непрямая схема с использованием меченых антивидовых антител является одной из наиболее распространенных схем ИФА. На поверхности носителя иммобилизуют конъюгат антиген-белок, к которому добавляют раствор, содержащий определяемый антиген и фиксированную концентрацию немеченых специфических антител, инкубируют и после удаления несвязавшихся компонентов добавляют фиксированную концентрацию меченых антивидовых антител. После инкубации и отмывки носителя детектируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов, причем величина сигнала находится в обратно-пропорциональной зависимости от концентрации определяемого антигена.
|
|
|
Применение универсального реагента — меченых антивидовых антител — даёт возможность выявлять антитела к разным антигенам. Кроме того, анализируемый образец и меченый реагент вводятся в систему на разных стадиях, что устраняет влияние различных эффекторов, содержащихся в образце, на каталитические свойства ферментной метки. Однако такая схема анализа усложняет его проведение из-за введения дополнительных стадий.
|
|
|
