 |
23. Методы определения аффинности антител: фракционное осаждение.
|
|
|
|
23. Методы определения аффинности антител: фракционное осаждение.
Методы фракционного осаждения используюся для разделения комплексов Аг-Ат и несвязавшегося Аг. Они основаны на способности комплексов Аг-Ат избирательно осаждаться различными реагентами (ПЭГ, сульфатом аммония, энатолом, вторичными Ат). При установлении в системе равновесия осаждающий реагент добавляют в такой концентрации при которой комплекс Аг-Ат и несвязавшиеся Ат становятся нерастворимыми и выпадают в осадок, который легко может быть удален центрифугированием.
Из интернета
Методы фракционного осаждения являются простыми, быстрыми и дешевыми и в практическом отношении превосходят все остальные методы разделения свободного и связанного лиганда. В тех случаях, когда эти методы могут быть использованы (практически во всех случаях, за исключением анализа очень больших белковых молекул), они обеспечивают высокую воспроизводимость результатов, причем различия между партиями реагентов бывают незначительными.
24. Гетерогенные методы ИФА антител, основанные на определении специфических иммунных комплексов (тип I).
К этому группе могут быть отнесены только три метода. При чем все они неконкурентные.
1. Метод с использование меченных вторичных антител и иммобилизованных антигенов.
К иммобилизованному антигену добавляют исследуемую сыворотку крови и после инкубации и удаления несвязавшихся компонентов выявления неспецифических иммунокомплексов проводят с помощью меченых ферментом антивидовых антител. Данная схема отличается универсальностью меченного реагента, что дает возможность выявлять антитела к разным антигенам.
|
|
|
2. Метод с использованием меченного антигена и иммобилизованного антигена.
Пробу инкубируют с иммобилизованным антигеном, после отмывки несвязавшихся компонентов для выявления образовавшегося специфического комплекса проводят инкубацию с меченным ферментов антигеном. Меченный антиген добавляется в избытке, чтобы обеспечит полное связывание с антителом и приводит к вытеснению слабо связанных антител из комплекса с антигеном.
3. Метод с использованием меченного антигена и иммобилизованных антивидовых антител.
На первой стадии иммобилизованные антивидовые антитела связывают из раствора все антитела соответствующего вида. Добавляют антиген с ферментом. Чувствительность снижается, если антиген может связываться с иммобилизованными антивидовыми антителами или с антителами, которые адсорбировались на носителе.
25. Определения аффинности антител методами гель-фильтрации, тушения биолюминесценции и деполяризации флуоресценции.
Гель-фильтрация. Метод трудоемок и не предназначен для исследования больших количеств образцов. Вследствие длительности процесса разделения равновесие может нарушаться.
Ig и иммунокомплексы будут выходить первыми, минуя полости шариков геля.
Эффект разбавления (локаьная концентрация в-ва снижается) + на гранулах могут находиться центры неспецифического свяывания.
Метод тушения биолюминесценции. Основан на использовании в качестве маркера АТФ, пришитой к молекуле Аг. В составе такого комплекса АТФ сохраняет активность в р-ции биолюминесценции, катализируемой светлячковой люциферазой. При добавлении Ат образуется комплекс с Аг, в котором мол. АТФ становится недоступной ферменту, в результате чего ингиируется р-ция биолюминесценции. Обладает высокой чувст-вительностью, что позволяет определять константы ассоциации до 10-12 М.
|
|
|
Метод деполяризацию флуоресценции. Основан на изменении поляризации флуоресценции Аг, меченного красителем, до взаимодействия с Ат и после комплексообразования. Поляризация флуоресценции определяется молекулярным объемом частицы и степенью ее ассиметрии. Комплексообразование Аг с Ат сопровождается резким изменением поляризации флуоресценции красителя (н. дансила), который играет роль метки Аг или Ат. Предел обнаружения Аг этими методами достаточно мал (10-9 – 10-10 М).
Недостатками являются необходимость работы с препаратами очищенных Ат и строгие требования к структуре изучаемых антигенов. Не являются универсальными и применимы для ограниченной группы Аг.
|
|
|
