 |
20. Гетерогенные методы ИФА антител, основанные на определении оставшихся незанятыми мест специфического связывания (тип II).
|
|
|
|
20. Гетерогенные методы ИФА антител, основанные на определении оставшихся незанятыми мест специфического связывания (тип II).
1) Метод с использованием меченных антител и иммобилизованного антигена
К иммобилиз. антигену добавляют анализируемый р-р. После отмывки добавляют меченные ферментов антитела той же специфичности и определяют ферментатив. актив., которая обратно пропорциональна количеству исслед. антител.
Тип метода: неконкурентный, твёрдофазный.
2)Метод с использование меченных антител и иммобилизованного антигена
К иммобилиз. антигену добавляют анализируемый р-р и р-р, содержащий фиксированное количество меченных ферментом антител. После инкубации и отмывки проводят измерение ферментатив. актив., которая обратно пропорциональна количеству исследуемого антитела.
Тип метода: конкурентный, твёрдофазный.
Минус: контакт фермент. метки с образцом, что может привести к изменению фермент. актив.
21. Методы определения аффинности антител: фракционное осаждение.
Методы фракционного осаждения используюся для разделения комплексов Аг-Ат и несвязавшегося Аг. Они основаны на способности комплексов Аг-Ат избирательно осаждаться различными реагентами (ПЭГ, сульфатом аммония, энатолом, вторичными Ат). При установлении в системе равновесия осаждающий реагент добавляют в такой концентрации при которой комплекс Аг-Ат и несвязавшиеся Ат становятся нерастворимыми и выпадают в осадок, который легко может быть удален центрифугированием.
Из интернета
Методы фракционного осаждения являются простыми, быстрыми и дешевыми и в практическом отношении превосходят все остальные методы разделения свободного и связанного лиганда. В тех случаях, когда эти методы могут быть использованы (практически во всех случаях, за исключением анализа очень больших белковых молекул), они обеспечивают высокую воспроизводимость результатов, причем различия между партиями реагентов бывают незначительными.
|
|
|
22. Гетерогенные методы ИФА антигенов, основанные на определении оставшихся незанятыми мест специфического связывания (тип II).
 |
 |  | ||
1) Неконкурентные
1. 1 Метод с использованием меченных антител и иммобилизованного антигена.
Принцип: к р-ру, содерж. фиксированное кол-во меченных ферментом специфич. антител, добавляют анализируемый образец. После инкубации добавляют иммобилиз. антигены, которые связывают оставшиеся свободными антитела. После повторной инкубации система отмывается. Далее проводится измерение ферментативной активности, которая обратно пропорциональна содержанию исслед. антигена в образце.
Тип метода: гомогенно-геторогенный.
Минусы метода: 1) с иммобилиз. антигенами могут связыватся уже «занятые» антитела, если антитело имеет несколько мест связывания, а антиген, в свою очередь, все места связывания не занимает (чем меньше антиген, тем больше вероятность такого исхода), что искажает результаты. 2) контакт фермент. метки с образцом, что может привести к изменению фермент. актив.
1. 2. Метод с использованием меченных вторичных антител и иммобилизованного антигена.
В отличии от первого метода, на первой стадии использ. немеченные антитела, а их комплексы с иммобилиз. антигенами выявляются с помощью вторичных антител.
Тип метода: гомогенно-гетерогенный.
Минус: долгий.
Плюсы: 1) исключение контакта ферментной метки с исследуемой жидкостью. 2) возможность использование одного и того же антивидового конъюгата для анализа разных антигенов.
|
|
|
1. 3. 
Метод с использованием меченного антигена и иммобилизованных антител (последовательного насыщения)
Иммобилиз. антитела конкурируют с раствором, содерж. Определяемый антиген. После отмывки к носителю добавляют меченный ферментом антиген, который взаимодействует со свободными антителами.
Тип метода: твердофазный
Плюс: исключение контакта ферментной метки с исследуемой жидкостью.
2) Конкурентные
2. 1. Метод с использованием меченных антител и иммобилизованного антигена
к иммобилиз. антигенам добавляют анализируемый образец и р-р с фиксированным количеством меченных ферментом антител. Далее отмывка и определение ферментатив. актив.
Определяемый антиген приводит к снижению уровня наблюдаемой ферментатив. актив.
Тип метода: твёрдофазный.
Минус: контакт фермент. метки с образцом, что может привести к изменению фермент. актив.
2. 2. Метод с использованием меченных вторичных антител и иммобилизованного антигена
в отличии от первого, на первой стадии используются немеченные специфические антитела, а для выявления обр. комплексов добавляются меченные ферментом вторичные антитела.
Тип метода: твёрдофазный.
2. 3. Метод с использованием меченного антигена и иммобилизованных антител
К иммобилиз. на носителе антителам добавляют исслед. р-р и р-р с фиксированным количеством меченного ферментом антигена. Далее отмывают и определяют фермент. актив, которая обратно пропорциональна концентрации исслед. антигена.
Тип метода: твёрдофазный.
Плюс: небольшое число стадий.
Минусы: 1) сложность и неуниверсальность методов синтезаза ферментатив. конъюгатов. 2) возможность снижения эффективности взаимодействия меченных антигенов с соответ. антителами. 3) контакт фермент. метки с образцом, что может привести к изменению фермент. актив.
|
|
|
