 |
29. Методы определения аффинности антител: равновестный диализ.
|
|
|
|
29. Методы определения аффинности антител: равновестный диализ.
Определение афинности антител в сыворотке сложная практическая и теоритическая задача. Трудности: 1) гетерогенность антител по физ-хим свойствам, в том числе по сродству к антигену; 2) сложность определения общего количества антител, а так же отдельных фракций; 3) в случаи поливалентных антигенов возможность образования комплексов сложного состава.
Нельзя применять традиционные методы для расчёта истинных констант связывания, которые важны для определения термодинамических характеристик процесса взаимодействия антиген-антитело. Для практич. целей достаточно знать эффективные значения, характериз. свойства используемых антител. Для расчёта необходимо знать концентрации свободного и связанного с антителами антигена в условиях равновесия. Обычно для этого используют меченные маркером антигены, благодаря которому их легко определить доступными методами.
Методы
1 группа: Стадия разделения свободного и связанного антигена осущ. путём избирательного осаждения, афинного связывания или гельфильтрации. Если Mr реагентов ильно различается, то процедура сильно упрощается. Если антигены корпускулярные: свободные антитела отделяются либо центрифугированием, либо пропусканием через фильтр, задерживающий антиген. Для гаптенов – равновесный диализ.
2 группа: Изменение физ-хим свойств антигенов при комплексообразовании с антителами: тушении или усилении флуоресценции, изменение степени поляризации флуоресценции, ингибирование фермент. актив.
Равновесный диализ – наиболее распространённый метод. Основанна различной способности антител и гаптена проходить через полупроницаемую мембрану. По обе стороны от мембраны помещают растворы антитела и гаптена с известной концентрацией. Гаптена буде проходить через мембрану (по градиенту концентрации) и связываться с антителом до тех пор, пока концентрация гаптена по обе стороны не станет равной. Измерив равновесную концентрацию гаптена, можно расчитать количество связанного гаптена и определить по уравнению константу связывания.
|
|
|
Минусы: 1) гаптены с низкой молекулярной массой (> 3000); 2) долго (более 24 часов); 3) эффекты мембраны (связываениегаптен с мембраной).
Выход: высокие концентрации реагентов, но падает чувствительность.
30. Носители, применяемые в ИФА.
Требования, применяемые к носителям:
1. Они должны быть нерастворимы при условиях, в которых проводится анализ.
2. Обладать достаточной для аналитических целей емкостью (т. е. количество иммобилизованного белка на единицу массы или площали поверхности носителя)
3. Обеспечивать прочное необратимое связывание белка с носителем и стабильность препарата при хранении
4. Обладать минимальной способностью к неспецефическому связыванию компонентов, находящихся в анализируемых биологических жидкостях
5. Быть удобным для анализа в методическом плане, т. е. легко и точно дозироваться, быстро осаждаться, без потерь подвергаться процедурам промывки и т. д.
Первоначально использовали целлюлозу, сефадекс, биогель, силохром, пористое стекло, оксиды металлов. Неорганические (силохром, пористое стекло) не подвержены воздействию микрофлоры, что позволяет использовать иммобилизованные на них антитела длительный срок без применения консервантов.
С начала 70-х в практику ИФА вошли методы, основанные на иммобилизации антител и антигенов непосредственно на стенках посуды, в которой проводится анализ. То есть используются пробирки и планшеты из непористых полимерных материалов – полистирола, поливинилхлорида, полиметакрилата и т. д. Многие вещества могут быть адсорбционно связаны с поверхностью таких полимеров, что значительно упрощает процедуру иммобилизации. В настоящее время этот подход является основным в практике твердофазного ИФА. Метод простой, отдельная лунка планшета или пробирка является отдельным реактором, в котором происходят все стадии анализа (т. е. есть возможность автоматизации). Недостатком данного подхода является невысокая емкость непористых материалов и возможность элюции части адсорбированного белка с подложки в процессе инкубаций и промывок, вследствие чего ухудшаются чувствительность, точность и воспроизводимость анализа.
|
|
|
Другой подход основан на использовании материалов в форме шариков, дисков или трубочек, каждый из которых предназначен для проведения одного анализа. Из пробирки в пробирку, во время отмывки и пр. перенос осуществляется пинцетом или вакуумной присоской. Иммобилизация может быть адсорбционной или ковалентной. Из плюсов: увеличение количества иммобилизованного белка за счет увеличения поверхности. Как пример – полимерные шарики, нитроцеллюлозные диски, силиконовые трубки, полимерные пленки и т. д.
|
|
|
