 |
31. Способы расчета констант комплексообразования реакции антиген-антитело.
|
|
|
|
31. Способы расчета констант комплексообразования реакции антиген-антитело.
Разные способы для разных взаимодействий. (примечание: в литературе быв-т обознач-т [Ат*Аг] символом В, а [Аг]-символом F, далее тоже будет такое)
Взаимодействие одной субпопуляции антител с моновалентным антигеном.
Это наиб. простой случай, реализуется, например, при связыв-и гаптена с Fab-фрагментами моноклональных антител и описывается простейшей схемой:
Аг + Ат ↔ Аг*Ат
Выражение равновесной концентрации образовавшегося комплекса
[Аг*Ат]= 
(1)
1) метод, состоящий в исследовании зависимости образующегося комплекса от общ. конц. антигена [Аг]0. Если при достат. больших конц-х антигена в системе выполняется условие [Аг]0> > [Ат]0, то при предельных значениях конц-и [Аг]0 концентрация комплекса [Аг*Ат] стремится к общей конц-и центров связывания [Ат]0. Для вычисления К определяют конц-ю антигена [Аг]`0, при которой половина антител нах-ся в виде комплекса с антигеном ([Аг*Ат]=[Ат]0/2).
Получаем, что [Аг]`0= 1/К при условии 1/К 
[Ат]0, (т. е. либо антитела являются низкоафинными; либо их концентрация мала). При обратном соотношении (1/К 
[Ат]0) данный метод определения неприемлем.
 |
2) Иногда для вычисления константы связывания К исп-т представление экспериментальных данных зависимости концентрации комплекса от концентрации свободного антигена в системе двойных обратных координат:
При пост. конц-и антител в системе варьируют начальн. конц-ю антигена и в условиях равновесия определяют концентрацию свободного и связанного в комплекс антигена.
График в двойных обратных координатах представляет собой прямую линию с тангенсом угла наклона 
, отсекающую на оси ординат отрезок 1/[Ат]0. В усл-х избытка антигена ([Аг]> > [Ат]0) анализ проводят в координатах 1/[Аг*Ат] 
1/[Аг]0
|
|
|
3) Метод Скэтчарда, основ-й на исследовании зависимости отношения равновесн. конц-и комплекса [Аг*Ат] к конц-и свободного антигена [Аг] от концентрации комплекса. Зависимость Скэтчарда имеет вид прямой с тангенсом угла наклона – К, отсекающей на оси ординат отрезок К [Ат]0, а на оси абсцисс [Ат]0. Графическая обработка эксперимент-х данных в координатах Скэтчарда позволяет вычислить не только равновесную константу связывания, но и концентрацию активных центров антител [Ат]0 в системе.
4) Метод Хилла. Уравнение [Ат*Аг]=Ка[Ат][Аг] с уч-м сист. уравн-й материального баланса м. преобр-ть опред-м образом, затем разделить числитель и знаменатель левой части на концентрацию антител [Ат]0 и логарифмируя выраж-е.
В координатах 
, называемых координатами Хилла, должна получаться прямая с тангенсом угла наклона, равным единице, пересекающая ось ординат в точке IgK.
Взаимодействие одной популяции антител с поливалентным антигеном. Рассматриваемый ниже случай может реализоваться, например, при связывании Fab-фрагментов моноклональных антител с клетками, вирусными частицами и т. д., имеющими на своей поверх-ти большое число одинак-х центров связывания. Выражение для константы равновесия взаимодействия антитела, имеющего по n эпитопов, записывается следующим образом:
Варьируя концентрацию антител в системе при постоянной концентрации [Аг]0, можно определить константу комплексообразования К и число мест связывания в антигене n.
|
|
|
