 |
Взаимодействие двух субпопуляций антител с моновалентным антигеном.
|
|
|
|
Взаимодействие двух субпопуляций антител с моновалентным антигеном.
(Будет вогнутый график. ) Модель взаимодействия моновалентного антигена(гаптена) с антителами, где популяция антител заменяется двумя – высокоаффинной и низкоаффинной, кажд. из которых характ-ся собственной константой комплексообразования – К1 и К2.
Для определения четырех неизвестных параметров К1, К2, [Ат1]0 и [Ат2]0 м. исп-ть след-й прием: параметры можно оценить по углам наклона асимптот гиперболы и отрезкам, отсекаемым ими на оси абсцисс и ординат. Для построения асимптот: по концевым участкам экспериментальной кривой проводят прямые, которые дают первоначальное приближение констант К1 и К2. Путем параллельного перемещения прямых подбирают такое их положение, чтобы сумма отрезков, отсекаемых ими на осях координат, была равна соответствующим отрезкам на тех же осях, отсекаемых самой кривой при экстраполяции ее к осям координат.
Отрезки на оси абсцисс и оси ординат дают оценочные значения для [Ат1]0 и [Ат2]0 соответственно. Подставляя оценочные значения К1, К2, [Ат1]0 и [Ат2]0 в выражения для В1 и В2 находят приближенные параметры В1 и В2 и В=В1+В2 при различ-х концен-х Аг. С использ-м полученных значений строят теоретич-ю зависимость B/F от В, сравнивают ее с экспериментальной и подбирают новые оценочные параметры до наилучшего совпадения теоретической и экспериментальной кривой.
32. Получение конъюгатов гаптен-фермент.
Синтез конъюгатов гаптенов с ферментами основаны в принципе на тех же методах, что и синтез конъюгатов белков с ферментами(чтобы не теряли активности ни ферментативной, ни иммунологической).
Особенности синтеза:
|
|
|
1) Многие гаптены плохо растворимы в водных растворах à получение конъюгатов приходится проводить в водно-органической среде, что сказывается на ферментативной активности конъюгата.
2) Бывает очень сложно очистить конъюгат от свободного фермента à высокие фоновые реакции, поэтому синтез должен быть выполнен с высоким выходом.
3) Для сохранения иммуногенных свойств, гаптен должен быть пришит к ферменту через углеводородную «ножку», содержащую 5—6 атомов цепи.
4) Место пришивки гаптена к ферменту долно быть тщательно выработано, т. к. это влияет на специфичность анализа. (специфичность анализа для гаптенов выше, если конъюгат фермент-гаптен получен способом, отличным от метода синтеза конъюгата гаптен-носитель, используемым для иммунизации. )
Получение конъюгатов ферментов с гаптенами, содержащими карбоксильную группу: самые распространенные методы, основанные на образовании пептидной связи между аминогруппой фермента и карбоксильной группой гаптена, предварительно активированной каким-либо реагентом.
Метод смешанных ангидридов. При взаимодействии гаптенов, содержащих СООН-группу, с изобутилхлорформиатом в безводном органическом растворителе при пониженной температуре легко получаются смешанные ангидриды, которые без выделения затем взаимодействуют с NH2-группами лизиновых остатков фермента:
(г)—СООН + СlСООСН2CH(СН3)2 
à [ (г)—СООСООСН2СН (СН3)2]à
à (г)— CONH—(Е) + СO2 + НОСН2СН(СН3)3
Этим методом получают конъюгаты большинства гаптенов. Но даже при 20—30-кратном избытке гаптена относительно фермента выход конъюгата не превышает 20—30%. Реакцию обычно проводят с добавлением основания (триэтиламин, трибутиламин) для удаления образующейся НС1.
После завершения реакции, реакц. смесь обраб-т гидроксиламином (для разрушения слабой сложноэфирной связи, к-рая побочно возникает между активированной карбоксильной группой гаптена и тирозиновым остатком фермента, а также для удаления избытка непрореагировавших реагентов.
|
|
|
Карбодиимидный метод. Активацию карбоксильной группы проводят с помощью водорастворимых карбодиимидов: гидрохлорида 1-этид-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида или n-толуолсульфоната-1-циклогексил-3-(2-N-метилморфолиноэтил)-карбодиимида:
(г)—СООН + RN=C=NR' à (г)—COOC(=NR)NR'H 
à (г)—CONH—(Е) + HRNC(=O)NHR'
где RN=C=NR': или CH3CH2N=C=NCH2CH2CH2N(CH3)2× HCI; или огромноая сложная формула.
Реакцию проводят обычно при pH 5, 5—6 в течение нескольких часов. Недостаток метода: побочное протекание внутри- и межмолекулярной сшивки молекул фермента.
Разновидностью метода является способ с применением N-оксисукцинимида и дициклогексилкарбодиимида в органической среде.
Получение конъюгатов ферментов с гаптенами, содержащими аминогруппы. (применяются гомобифункциональные сшивающие реагенты): просто смешивают в щелочной среде фермент, гаптен и сшивающий реагент (глутаровый альдегид или диметил-адипимидата). Выход конъюгата этим методом невелик и значительно падает его ферментативная активность. Лучше проводить в 2 стадии: сначала обрабатывают гаптен сшивающим реагентом, а затем уже добавляют его к раствору фермента.
Метод с применением гетеробифункциональных сшивающих реагентов. (для гаптенов, содержащих NH2-группы)
гетеробифункциональные сшивающие реагенты (пример N-оксисукцинимидный эфир м-малеимидобензойной кислоты (MBS) и др. ) Этим методом получают конъюгаты в основном с бетта-D-галактозидазой, которая содержит ~ 10 активных SH-групп и не теряет свою ферментативную активность в конъюгате, а также и с другими ферментами, содержащими SH-группы.
С гаптенами, содержащими углеводные остатки. Такие гаптены, как дигоксин, аденозин и др., имеющие в своей структуре углеводные группировки, могут быть легко конъюгированы с ферментами путем их окисления перйодатом натрия до производных с альдегидной группой и последующим взаимодействием с NН2-группами фермента.
|
|
|
