 |
Планшет 2: Тестируемые сыворотки
|
|
|
|
Планшет 2: Тестируемые сыворотки
Log разведения 0, 48 0, 95 1, 43 1, 91 2, 39 4, 23 0, 48 0, 95 1, 43 1, 91 2, 39 4, 23
2. 1. 6. Добавление стандарта контрольного вируса
i i) Исходный стандарт контрольного вируса храните в 1мл микропробирках при – 800С. Содержимое одной пробирки подвергните быстрому оттаиванию под холодной водопроводной водой и поместите на тающий лёд.
i ii) Из этой пробирки приготовьте одно разведение с целью получения 100 ТЦД50 в 50 мкл. Из этого разведения в каждую наполненную сывороткой лунку добавьте 50 мкл (см. Рисунок 1). Для титрования вируса в лунки от Н1 до Н4 (планшет 1) добавьте 50 мкл. Затем переносите 50 мкл из ряда в ряд (планшет 1, линии 1-4). Удалите 50 мкл из последнего ряда (планшет 1, лунки от А1 до А4). К лункам от А9 до А12 планшета 1 (контроли) вирус не добавлять. Титр вирусной дозы должен находиться в пределах от 30 до 300 ТЦД50 в 50 мкл.
i iii) Инкубируйте микропланшеты при 35-370С во влажном инкубаторе с 5% СО2 в течение 1 часа.
i iv) Добавление клеток: подвергните трипсинизации субконфлюэнтную культуру ВНК-21 клеток. Ресуспендируйте клетки до получения суспензии 4 х 105 клеток/мл в модифицированной Дульбекко среде Игла, обогащённой 10% инактивированной высокими температурами ФТС. Добавьте 50 мкл клеточной суспензии в каждую лунку.
i v) Инкубируйте микропланшеты в течение 48 часов при 35-370С во влажном инкубаторе с 5% СО2.
2. 1. 7. Фиксация и окрашивание
i i) Через 48 часов инкубационного периода среду выбрасывают и микропланшеты ополаскивают один раз в ЗФР, рН 7, 2, и один раз в 80% ацетоне. Затем микропланшеты фиксируют в 80% ацетоне при комнатной температуре в течение 30 минут (без крышки) и сушат при комнатной температуре, по меньшей мере, в течение 30 минут.
|
|
|
i ii) Добавьте 50 мкл флуоресцеин изотиоцинат антирабического конъюгата в рабочем разведении в каждую лунку, осторожно покачайте микропланшеты и инкубируйте при 35-370С в течение 30 минут. Удалите флуоресцирующий конъюгат и ополосните микропланшеты дважды с использованием ЗФР. Излишки ЗФР удалите на абсорбирующую бумагу путём быстрого переворачивания микропланшетов.
2. 1. 8. Считывание и интерпретация результатов
i i) Наблюдение проводят за всей поверхностью каждой лунки. Результат оценивается качественным образом (плюс или минус): отсутствие флуоресцирующих клеток – минусовой счёт регистрируется в отношении лунки; наличие флуоресцирующих клеток (одна клетка или более) – плюсовой счёт регистрируется в отношении лунки.
i ii) Сначала снимают показания с контрольных лунок. В контрольных лунках проводят титрование стандарта контрольного вируса, незаражённой сыворотки и стандартных сывороток (стандартная сыворотка ВОЗ и/или стандартная сыворотка МЭБ), титры подсчитывают в соответствии с методом Spearman-Kä rber или неопробит-графическим методом (ВОЗ, 1996).
i iii) Результаты титрования стандарта контрольного вируса (TЦД50), незаражённой сыворотки (Д50 [средняя доза]) и положительного стандарта (Д50) регистрируют в контрольной карточке для каждого из этих трёх контролей. Контрольные результаты текущего теста сравнивают с контрольными опытными результатами, накопленными при проведении предшествующих тестов с использованием той же серии контроля. Тест можно считать прошедшим валидацию, если значения, полученные для трёх контролей текущего теста, статистически не отличаются от средней величины всех значений, полученных в тестах, которые были проведены ранее в соответствии с этим методом.
i iv) Результат теста соответствует не нейтрализованному вирусу после инкубирования с референтной сывороткой или с опытной сывороткой. Эти титры подсчитывают с использованием неопробит-графического метода или формулы Spearman-Kä rber (ВОЗ, 1996). Сравнение измеренного титра опытных сывороток с
|
|
|
i известным нейтрализующим титром положительной стандартной сыворотки позволяет определить нейтрализующий титр опытных сывороток в МЕ/мл. Перевод в МЕ/мл осуществляется посредством использования как дневной величины log D50, так и средней величины стандартной сыворотки МЭБ.
2. 1. 9. Формула для перевода log D50 в МЕ/мл титра:
[(10(величина сыворотки log D50)) х теоретический титр сыворотки МЭБ 0, 5 МЕ/мл]
Титр сыворотки (МЕ/мл)= ---------------------------------------------------------------------------------
(10 (log D50сыворотки МЭБ 0, 5 МЕ/мл))
Пример перевода величин:
log D50 сыворотки = 2, 27
теоретический титр сыворотки МЭБ 0, 5 МЕ/мл = 0, 5 МЕ/мл
log D50 сыворотки МЭБ = 1, 43
(для log D50 МЭБ могут учитываться как величина дня, так и средняя величина)
102, 27 х 0, 5
Титр сыворотки (МЕ/мл) = ------------------ =3, 46 МЕ/мл
(101, 43)
Следует строго соблюдать следующие параметры:
• • Вирус бешенства: могут быть использованы только штамм CVS-11
• • Клеточная культура: могут быть использованы только клетки ВНК-21 (номер АТСС-CCL 10).
• • Реакция флюоресценции вируснейтрализующих антител (FAVN) должен проводиться только в 96-луночном планшете.
• • Контрольные карты должны использоваться для вируса бешенства, незараженной сыворотки и положительной стандартной собачьей сыворотки.
• • На контрольном планшете должны быть представлены обратное титрование стандарта контрольного вируса, незараженная сыворотка и положительная стандартная собачья сыворотка.
• • Требуется минимум четыре трехкратных разведений сыворотки. Метод считывания работает по принципу «все или ничего».
• • Должно быть разведено четыре репликата каждой сыворотки.
• • Для перевода log D50 в МЕ/мл лаборатории должны использовать только величину log D50 положительной стандартной собачьей сыворотки.
|
|
|
