 |
2.1 Реакция вируснейтрализации в культуре клеток: реакция вируснейтрализации с флуоресцирующими антителами (тест, предписанный для международной торговли)
|
|
|
|
2. 1 Реакция вируснейтрализации в культуре клеток: реакция вируснейтрализации с флуоресцирующими антителами (тест, предписанный для международной торговли)
Принцип реакции вируснейтрализации с флуоресцирующими антителами (Cliquet et al., 1998) заключается в нейтрализации in vitro постоянного количества вируса бешенства (штамм «стандарта контрольного вируса», адаптированный к клеточной культуре) перед инокуляцией клеток, чувствительных к вирусу бешенства: клеток ВНК-21 С13 (номер ATCC: CCL-10).
Титр сыворотки - это разведение, при котором 100% вируса нейтрализуется в 50% лунках. Этот титр выражается в МЕ/мл в результате сравнения его с нейтрализующим разведением сыворотки МЭБ собачьего происхождения в тех же экспериментальных условиях. Можно использовать стандарт ВОЗ для иммуноглобулина бешенства (человека)2 № 2, или внутренний контроль, откалиброванный против международного контроля. Стандарт ВОЗ или внутренний контроль должны использоваться при проведении теста только в качестве контроля, а не для подсчета МЕ/мл титра сыворотки.
2 Национальный институт биологических стандартов и контроля (NIBSC). Blanche Lane, South Mimms, Potters Bar, Hertfordshire EN6 3QG, Соединенное Королевство (UK).
При постановке этого метода используют 96-луночные планшеты, а сам он является адаптацией метода Smith et al. (1973). В нескольких публикациях было показано, что реакция вируснейтрализации с флуоресцирующими антителами и быстрая реакция подавления флуоресцирующего фокуса дают эквивалентные результаты (Cliquet et al., 1998).
2. 1. 1. Необходимое оборудование
Влажный инкубатор при 370С\370С с 5% СО2; сухой инкубатор при 370С; шкаф для работы с биоматериалом; флуоресцентный микроскоп, подходящий для флуоресценции с флуоресцеин изотиоцианатом и оборудованный х10 окуляром и х10 объективом. Увеличение микроскопа варьирует от х100 до х125 из-за дополнительного увеличения некоторых эпифлуоресцентных систем.
|
|
|
• • Реактивы и биологические препараты
ЗФР, рН 7, 2, без Са2+ и Mg2+, хранящийся при 40С;
Трипсин этилен диамин тетрауксусная кислота (EDTA);
Высококачественный ацетон 80% (разведённый деионизированной водой), хранящийся при 40С;
Модифицированная Дульбекко среда Игла + 10% инактивированная высокими температурами фетальная телячья сыворотка;
Флуоресцеин изотиоцианат антикроличий конъюгат;
Клетки: ВНК-21 С13 (АТСС ССL-10), хранящиеся в GMEM с 10% фетальной телячьей сывороткой и антибиотиками;
Вирус: Штамм стандарта контрольного вируса - 11 (ATCC VR 959), который можно получить из АТСС или Справочной лаборатории МЭБ по бешенству, Нэнси, Франция (см. Таблицу в Части 4 данного Руководства по наземным животным). Пузырьки хранят при –800С;
Стандарт сыворотки МЭБ собачьего происхождения (Справочная лаборатория МЭБ по бешенству, Нэнси, Франция [см. Таблицу в Части 3 данного Руководства по наземным животным], хранящийся при +40С и разведённый до 0, 5 МЕ/мл стерильной деионизированной или дистиллированной водой согласно титру партии). Данная контрольная сыворотка может быть использована для калибровки внутреннего контроля, который применяется для реакции вируснейтрализации с флуоресцирующими антителами:
Незаражённая сыворотка: Пул отрицательной собачьей сыворотки хранится при -200С.
2. 1. 3. Получение стандарта контрольного вируса
i i) Выращивание клеток: ВНК-21 С13 клетки (АТСС CCL-10), используемые для получения стандартного контрольного вируса (АТСС VR 959 CVS-11), подвергают трипсинизации во время фазы быстрого роста, а именно тогда, когда клетки находятся в экспоненциальной фазе их кинетического роста. Если слияние слоя полное, тогда необходимо провести новый пассаж. Клетки в клеточной суспензии не должны аггрегироваться; в одном 75-см3 флаконе для клеточной культуры должно находиться 2 х 107 клеток. Клетки в объёме 20-30 мл помещают в клеточную культуральную среду с 10% инактивированной высокими температурами фетальной телячьей сывороткой.
|
|
|
i ii) Заражение клеток: множественность заражения (количество инфекционных частиц на клетку) подгоняется под диапазон между 0, 1 и 0, 5. Стеклянную бутылочку, содержащую суспензию вируса и клеток, инкубируют в течение 60 минут при 35, 5 – 370С. Содержимое бутылочки осторожно помешивают каждые 10-15 минут.
i iii) Выращивание вируса: суспензию вируса и клеток затем центрифугируют при 800 – 1000 g в течение 15 минут и клеточный осадок ресуспендируют в клеточной культуральной среде, смешанной с 10% инактивированной высокими температурами фетальной телячьей сывороткой. Урожай вируса собирают 2 дня спустя.
i iv) Сбор урожая и хранение: надосадочную жидкость центрифугируют при 800 – 1000 g в течение 15 минут при 40С. Если используются несколько флаконов, тогда различные отцентрифугированные надосадочные жидкости смешивают, а затем делят на равные части и замораживают при –800С. Инфекционный титр урожая определяют, по меньшей мере, через 3 дня после замораживания.
|
|
|
