 |
1.3. Лабораторные тесты. 1.3.1. Иммуногистохимическая идентификация антигена вируса бешенства
|
|
|
|
1. 3. Лабораторные тесты
1. 3. 1. Иммуногистохимическая идентификация антигена вируса бешенства
i) Реакция флуоресцирующих антител
Наиболее широко используемым для диагностики бешенства тестом является реакция флуоресцирующих антител, которая рекомендована как ВОЗ, так и МЭБ. Эту реакцию «золотого стандарта» можно проводить непосредственно на мазке и её можно использовать также для подтверждения присутствия антигена вируса бешенства в клеточной культуре или в ткани головного мозга мышей, которые были привиты для постановки диагноза. Реакция флуоресцирующих антител даёт надёжные результаты на свежих образцах в течение нескольких часов в более чем 95-99% случаев. Реакция флуоресцирующих антител обладает чувствительностью, специфичностью, и она является относительно дешевой. Чувствительность реакции флуоресцирующих антител зависит от образца (степени автолиза и от того, насколько полно были отобраны образцы головного мозга, см. Раздел В. 1. ) (Barrat & Aubert, 1995), типа лиссавируса и квалификационных навыков диагностов. Для прямой диагностики бешенства мазки, приготовленные из объединенного образца ткани головного мозга, который включает ствол головного мозга, фиксируют в высококачественном охлаждённом ацетоне, в течение, по крайней мере 20 минут, затем сушат и окрашивают каплей специфического конъюгата в течение 30 минут при температуре 37°С. Флуоресцирующие конъюгаты против бешенства, которые имеются в продаже, представляют из себя поликлональные или моноклональные
конъюгаты, специфические для полного вируса или специфические для нуклеокапсидного белка вируса бешенства, конъюгированного с флуороформ, таким как флуоресцинизотиоцианат. Затем, слайды, использующиеся в реакции флуоресцирующих антител, должны быть исследованы на специфическую флюоресценцию с использованием флуоресцентного микроскопа и фильтра, подходящего для длины волны специфической флуоресценции используемого флуоресцентного конъюгата, например, широко используемый FITC, который приводится в возбуждение при 490 nm и переизлучается при 510 nm. Специфические агрегаты нуклеокапсидного белка идентифицируются по специфичной флуоресценции связанного конъюгата. Рекомендуется, чтобы результаты каждого FAT слайда считывали два независимых обученных оператора. Конъюгаты флуорисцирующих антител могут изготавливаться на месте, но перед использованием их следует проверять на специфичность и чувствительность, включая их способность обнаруживать лиссавирусы помимо бешенства.
|
|
|
Реакцию флуоресцирующих антител можно использовать применительно к хранящимся в глицерине образцам после стадии отмывания. Если же образец хранится в растворе формалина, тогда реакцию флуоресцирующих антител можно использовать только после того, как образец будет обработан протеолитическим ферментом (Warner et al., 1997). Однако реакция флуоресцирующих антител на фиксированных формалином и расщеплённых образцах всегда даёт менее надёжные результаты и является менее надежной и более громоздкой по сравнению с реакцией флуоресцирующих антител на свежей ткани (Barrat, 1992).
Если результаты реакции флуоресцирующих антител неопределенные или если имело место заражение человека, то рекомендуется проводить дальнейшие исследования на том же образце или повторить реакцию флуоресцирующих антител на других образцах. Это особенно важно, когда подтвержден автолиз или есть на него подозрение.
ii) Иммунохимические тесты
Иммунопероксидазный метод может использоваться в качестве альтернативы реакции флуоресцирующих антител с той же самой чувствительностью (Lembo et al., 2006), но необходимо обратить внимание на риск получения неспецифических ложноположительных результатов. Этот риск можно существенно снизить путём
|
|
|
тщательной подготовки лаборантов. Следует также подчеркнуть, что постановка этого метода требует более длительной инкубации на один этап по сравнению с реакцией флуоресцирующих антител.
Пероксидазный конъюгат может применяться на срезах фиксированной формалином ткани для иммуногистохимических тестов.
ii) Иммуноферментный анализ (ИФА)
Одним из вариантов иммунохимического теста является иммуноферментный анализ (ИФА), с помощью которого обнаруживают антиген вируса бешенства. Он применяется для крупномасштабных эпизоотологических анализов (Xu et al., 2007). До начала использования необходимо проверять специфичность и чувствительность таких тестов для обнаружения местных преобладающих вариантов вируса. В случае контакта с человеком эти тесты должны использоваться в комбинации с подтверждающими тестами, такими как реакция флуоресцирующих антител или выделение вируса.
iv) Реакция экспресс иммунодиагностики (RIDT)
Реакция экспресс иммунодиагностики (RIDT), была разработана недавно (Kang et al., 2007). Этот простой тест может быть использован в полевых условиях и в развивающихся странах, обладающих ограниченными ресурсами для диагностики.
Вообще, все тесты помимо реакции флуоресцирующих антител могут быть использованы только после проведения валидации в многочисленных лабораториях.
|
|
|
