 |
2.2. Быстрая реакция подавления флуоресцирующего фокуса для определения нейтрализующих вирус бешенства антител (предписанный для международной торговли тест)
|
|
|
|
2. 2. Быстрая реакция подавления флуоресцирующего фокуса для определения нейтрализующих вирус бешенства антител (предписанный для международной торговли тест)
Стандартная процедура (из «Лабораторных методов ВОЗ для бешенства», 1996)
2. 2. 1. Приготовление суспензии посевного вируса
i i) Подвергните трипсинизации 150 мл флакон с 3-дневной культурой клеток нейробластомы мышей3. Схожую клеточную линию (CCL-131) можно запросить из ATCC (См. сноску 1).
i ii) Ресуспендируйте 3 х 107 клеток в 50 мл конической центрифужной пробирке в 2, 7 мл минимальной эссенциальной среде Игла, обогащённой 10% фетальной телячьей сывороткой (ЕМЕМ – 10).
i iii) Применяя стандартные процедуры безопасности в отношении бешенства, добавьте 1 х 107 инфекционных единиц стандарта контрольного вируса бешенства - 11 (предварительный АТСС референтный VR959) и вихревым движением перемешайте один раз. Инкубируйте клетки и вирус в течение 15 минут при 370С; вихревым движением перемешайте клетки один раз в течение этого периода времени.
i iv) Добавьте 10 мл ЕМЕМ - 10, вихревым движением перемешайте и центрифугируйте клетки при 500 g в течение 10 минут.
i v) Удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в 30 мл ростовой среды и перенесите в 150 мл флакон.
i vi) Осторожно покачайте флакон для того, чтобы перемешать клеточную суспензию, а затем подготовьте три предметных восьмилуночных стекла для культуры ткани путём переноса с помощью пипетки 0, 2 мл клеточной суспензии в одну лунку каждого предметного стекла.
i vii) Инкубируйте флакон и предметные стёкла при 37º С во влажном инкубаторе с 0, 5% двуокисью углерода (СО2). Флакон следует инкубировать как закрытую культуру (плотно закройте крышку).
|
|
|
i viii) Через 20, 40 и 64 часа после заражения зафиксируйте ацетоном и окрасьте один слайд с использованием реакции иммунофлуоресценции (Cliquet et al., 1998) с целью определения инфекционности вируса. Надосадочную жидкость следует собирать через 24 часа после того, как клетки достигнут 100% инфекционности (обычно через 40 часов после заражения).
i ix) Перенесите надосадочную жидкость в 50 мл центрифужную пробирку и центрифугируйте при 4000 g в течение 10 минут.
i x) Поделите надосадочную жидкость на 0, 5 мл равные части и храните при - 70°С.
2. 2. 2. Титрование суспензии посевного вируса
i i) Оттайте одну аликвоту посевного вируса и приготовьте серийные десятикратные разведения (от 10-1 до 10-8) в ЕМЕМ-10.
i ii) Поместите 0, 1 мл каждого разведения вируса в одну лунку восьмилуночного предметного стекла для культуры ткани. Добавьте 0, 2 мл клеток нейробластомы мышей, суспендированных в ЕМЕМ -10 (концентрация 5 х 104 клеток на 0, 2 мл), в каждую лунку.
ii iii) Перемешайте клетки и вирус путём осторожного покачивания предметного стекла, затем инкубируйте при 37°С во влажном инкубаторе с 0, 5% СО2 в течение 40 часов.
i iv) Зафиксируйте ацетоном и окрасьте предметное стекло с помощью реакции иммунофлуоресценции. Наличие вирусной инфекции должно наблюдаться при 10-6 разведении вируса, это будет свидетельствовать о том, что вирусная исходная суспензия содержит, по меньшей мере, 1х106 инфекционных единиц на 0, 1 мл. Приготовьте достаточное количество посевного вируса с тем, чтобы отпала необходимость частого серийного пассирования вируса.
2. 2. 3. Приготовление исходной вирусной суспензии
i i) Заразите 3 х 107 клеток нейробластомы мышей 1 х 107 инфекционными единицами препарата посевного вируса (см. выше).
|
|
|
i ii) Соберите надосадочную жидкость через 24 часа после того, как клетки достигнут 100% инфекционность (обычно через 40 часов после заражения).
i iii) Разделите надосадочную жидкость на равные части по 0, 5 мл и храните при -70°С.
2. 2. 4. Титрование исходной вирусной суспензии
i i) Оттайте одну аликвоту исходного вируса и используйте её для приготовления серийных десятикратных разведений (от 10-1 до 10-6) в ЕМЕМ-10.
i ii) Поместите 0, 1 мл каждого вирусного разведения в одну лунку восьмилуночного предметного стекла для культуры ткани. Добавьте 0, 2 мл клеток нейробластомы мышей, суспендированных в ЕМЕМ-10 (концентрация 1 х 105 клеток на 0, 2 мл), в каждую лунку.
i iii) Перемешайте клетки и вирусную суспензию путём осторожного покачивания предметного стекла, затем инкубируйте при 370С во влажном инкубаторе с 0, 5% СО2 в течение 20 часов.
i iv) Зафиксируйте ацетоном и окрасьте с помощью реакции иммунофлуоресценции.
При проведении наблюдения с помощью микроскопа с увеличением × 160-200 можно видеть, что каждая лунка восьмилуночного предметного стекла для культуры ткани содержит 25-50 отдельных микроскопических полей. Одна единица вируса для быстрой реакции подавления флуоресцирующего фокуса определяется как разведение, при котором 50% наблюдаемых микроскопических полей содержат один или более фокусов инфицированных клеток (фокусобразующая доза, ФОД50). Исходная вирусная суспензия
должна содержать, по меньшей мере, 1 х 104 ФОД50 в 0, 1 мл (а именно, лунка с клетками, инфицированными 10-4 разведением вируса, должна содержать, по меньшей мере, один фокус инфицированных клеток в 50% наблюдаемых микроскопических полей). Исходную вирусную суспензию с таким титром можно затем развести до 10-2, 3 с целью получения контрольного вируса, содержащего 50 ФОД50.
|
|
|
